Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第1期 肖心儒，范 亮，施宇佳，等. A2M在慢性阻塞性肺疾病中的表达及其与免疫细胞浸润的
2024年1月 相关性［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（01）：001-011，059 · 3 ·
10 min，分离血清，通过 ELISA 检测 A2M 蛋白水平； Arg⁃1）和抗内参 GAPDH 的一抗（Abcam 公司，英
另留存 5 mL 全血用于 RT⁃qPCR 测定 A2M 的 mRNA 国），4 ℃摇床孵育过夜。次日 TBST 洗涤 3 次，山羊
表达水平。所有受试者的血液样本均储存于-80 ℃。 抗兔IgG二抗（上海碧云天公司）在室温下孵育1.5 h
1.2.2 细胞培养及处理 后，再用 TBST 洗涤 3 次。使用 ECL 显影液（上海碧
巨噬细胞系 Raw264.7（武汉普诺赛公司）使用 云天公司）在化学发光成像程序系统进行曝光拍
DMEM 培养基培养于 37 ℃、5%CO2 的恒温培养箱 照。Image J软件用于结果分析。
内，DMEM 含有 10%胎牛血清和 1%双抗。使用终 1.2.6 肺功能的测定
浓度为 50 ng/mL 的白细胞介素（interleukin，IL）⁃4 本研究使用肺功能仪（耶格公司，德国），根据
和 IL⁃13 诱导 Raw264.7 细胞 24 h 成为 M2 型巨噬细 2019 年肺活量测定标准 ［13］ 对受试者进行坐位肺功
胞（细胞形态为类圆形或纺锤形贴壁）；随后用脂质 能检查，在整个测试过程中操作者持续观察容积和
体3 000（赛默飞公司，美国）将A2M siRNA（福州尚亚 流量曲线，并测量 FVC、FEV1和 FEV1/FVC 以及其他
公司）转染至M2型巨噬细胞；最后分别于转染48 h和 肺功能测试参数并计算预期值，记录3次测量数值，
72 h后提取RNA和蛋白用于进一步研究。 将最高值认定为基值，同时FVC和FEV1的最佳值和
1.2.3 ELISA测定 次佳值之间的差异应小于0.10 L。
根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（江苏酶 1.2.7 生物信息学分析
标公司）检测血浆样品中A2M的总浓度。在450 nm 从GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）
处获得标准品和样品的吸光度值，并比较为每种测 中筛选芯片数据集，选择标准如下：①数据集必须
定构建的标准曲线，并用于最小化测定间差异。 包含全基因组表达mRNA 微阵列数据；②数据集应
1.2.4 RT⁃qPCR检测 包括 COPD 患者和正常吸烟者的肺组织标本；③数
使用 RNAliquid 超速全血总 RNA 提取试剂盒 据集样本数量必须>20。基于以上标准，获得了
（北京汇天东方科技有限公司）提取总RNA，实验步 GSE38974 基因表达谱数据集，GSE38974 包含来自
骤按照说明书进行。使用紫外线分光光度计对提 COPD患者的23个肺组织样品和来自正常吸烟者的
取的RNA浓度及纯度进行检测。使用第一链cDNA 9个肺组织样品。
合成试剂盒（南京诺唯赞公司）合成第一链互补 1.2.7.1 差异表达基因和富集分析
DNA。使用 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南 使用 R 软件“Limma”识别 COPD 样本和健康对
京诺唯赞公司）进行 RT⁃qPCR，以评估 mRNA 表达 照组样本之间的差异表达基因。以调整后的P < 0.05
的程度。用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2 -ΔΔCT 和 |log2 fold change| ≥1 作为截断值。使用 R 软件
法进行数据的相对定量分析。引物由苏州吉玛公 clusterProfiler包进行GO和KEGG分析。
司提供，序列如下：homo⁃A2M（F：5ʹ⁃AGGAAATCG⁃ 1.2.7.2 GSVA分析
CATCGCACAATG ⁃ 3ʹ；R：5ʹ ⁃ ACGGTGAAAGGGT⁃ GSVA 能评估每个样本中通路活性的潜在变
GCTCTG⁃3ʹ）；homo⁃β⁃actin（F：5ʹ⁃CGTGGACATCCG⁃ 化。使用R软件中的“GSVA”包进行分析，计算所有
CAAAGA⁃3ʹ；R：5ʹ⁃GAAGGTGGACAGCGAGGC⁃3ʹ）； 样本中通路的富集评分。
mus⁃A2M（F：5ʹ⁃AGGAATCTGCCCGAGCTTCT⁃3ʹ；R： 1.2.7.3 免疫细胞浸润的评估
5ʹ⁃ATGGCCTTGGTCTTGATCTCC⁃ 3ʹ）；mus⁃β⁃actin 本研究使用“CIBERSORTx”网站（https：//ciber⁃
（F：5ʹ ⁃ TGTCCACCTTCCAGCAGATGT ⁃ 3ʹ；R：5ʹ ⁃ sortx.stanford.edu）估算了 GSE38974 样本中 22 种免
AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG⁃3ʹ）。 疫细胞的比例。
1.2.5 Western blot实验 1.3 统计学方法
收集经处理的各组细胞，4 ℃下 12 000 g 离心 使用 SPSS26.0 和 GraphPad Prism7 对实验数据
10 min 后，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液 进行统计分析。采用 Kolmogorov⁃Smirnov 检验测量
（上海碧云天公司）中裂解 30 min。使用 BCA 蛋白 数据的正态性。符合正态分布的测量数据表示为
测定试剂盒（上海碧云天公司）测定蛋白含量。蛋 均数±标准差（x ± s），分类变量数据表示为例数（百
白质样品经 10%凝胶（上海雅酶公司）电泳后转移 分率）［n（%）］。组间比较采用χ 检验或 Fisher 确切
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到 PVDF 膜上，利用快速封闭液（上海碧云天公司） 概率法检验。若符合正态分布，对连续变量使用
对PVDF膜封闭20 min，加入抗精氨酸酶（arginase⁃1， t 检验。采用Pearson相关分析对正态分布的资料进
