Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第44卷第1期 肖心儒,范 亮,施宇佳,等. A2M在慢性阻塞性肺疾病中的表达及其与免疫细胞浸润的
2024年1月 相关性[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2024,44(01):001-011,059 · 3 ·
10 min,分离血清,通过 ELISA 检测 A2M 蛋白水平; Arg⁃1)和抗内参 GAPDH 的一抗(Abcam 公司,英
另留存 5 mL 全血用于 RT⁃qPCR 测定 A2M 的 mRNA 国),4 ℃摇床孵育过夜。次日 TBST 洗涤 3 次,山羊
表达水平。所有受试者的血液样本均储存于-80 ℃。 抗兔IgG二抗(上海碧云天公司)在室温下孵育1.5 h
1.2.2 细胞培养及处理 后,再用 TBST 洗涤 3 次。使用 ECL 显影液(上海碧
巨噬细胞系 Raw264.7(武汉普诺赛公司)使用 云天公司)在化学发光成像程序系统进行曝光拍
DMEM 培养基培养于 37 ℃、5%CO2 的恒温培养箱 照。Image J软件用于结果分析。
内,DMEM 含有 10%胎牛血清和 1%双抗。使用终 1.2.6 肺功能的测定
浓度为 50 ng/mL 的白细胞介素(interleukin,IL)⁃4 本研究使用肺功能仪(耶格公司,德国),根据
和 IL⁃13 诱导 Raw264.7 细胞 24 h 成为 M2 型巨噬细 2019 年肺活量测定标准 [13] 对受试者进行坐位肺功
胞(细胞形态为类圆形或纺锤形贴壁);随后用脂质 能检查,在整个测试过程中操作者持续观察容积和
体3 000(赛默飞公司,美国)将A2M siRNA(福州尚亚 流量曲线,并测量 FVC、FEV1和 FEV1/FVC 以及其他
公司)转染至M2型巨噬细胞;最后分别于转染48 h和 肺功能测试参数并计算预期值,记录3次测量数值,
72 h后提取RNA和蛋白用于进一步研究。 将最高值认定为基值,同时FVC和FEV1的最佳值和
1.2.3 ELISA测定 次佳值之间的差异应小于0.10 L。
根据制造商的说明,使用ELISA试剂盒(江苏酶 1.2.7 生物信息学分析
标公司)检测血浆样品中A2M的总浓度。在450 nm 从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)
处获得标准品和样品的吸光度值,并比较为每种测 中筛选芯片数据集,选择标准如下:①数据集必须
定构建的标准曲线,并用于最小化测定间差异。 包含全基因组表达mRNA 微阵列数据;②数据集应
1.2.4 RT⁃qPCR检测 包括 COPD 患者和正常吸烟者的肺组织标本;③数
使用 RNAliquid 超速全血总 RNA 提取试剂盒 据集样本数量必须>20。基于以上标准,获得了
(北京汇天东方科技有限公司)提取总RNA,实验步 GSE38974 基因表达谱数据集,GSE38974 包含来自
骤按照说明书进行。使用紫外线分光光度计对提 COPD患者的23个肺组织样品和来自正常吸烟者的
取的RNA浓度及纯度进行检测。使用第一链cDNA 9个肺组织样品。
合成试剂盒(南京诺唯赞公司)合成第一链互补 1.2.7.1 差异表达基因和富集分析
DNA。使用 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南 使用 R 软件“Limma”识别 COPD 样本和健康对
京诺唯赞公司)进行 RT⁃qPCR,以评估 mRNA 表达 照组样本之间的差异表达基因。以调整后的P < 0.05
的程度。用ABI 7300型荧光定量PCR仪,采用2 -ΔΔCT 和 |log2 fold change| ≥1 作为截断值。使用 R 软件
法进行数据的相对定量分析。引物由苏州吉玛公 clusterProfiler包进行GO和KEGG分析。
司提供,序列如下:homo⁃A2M(F:5ʹ⁃AGGAAATCG⁃ 1.2.7.2 GSVA分析
CATCGCACAATG ⁃ 3ʹ;R:5ʹ ⁃ ACGGTGAAAGGGT⁃ GSVA 能评估每个样本中通路活性的潜在变
GCTCTG⁃3ʹ);homo⁃β⁃actin(F:5ʹ⁃CGTGGACATCCG⁃ 化。使用R软件中的“GSVA”包进行分析,计算所有
CAAAGA⁃3ʹ;R:5ʹ⁃GAAGGTGGACAGCGAGGC⁃3ʹ); 样本中通路的富集评分。
mus⁃A2M(F:5ʹ⁃AGGAATCTGCCCGAGCTTCT⁃3ʹ;R: 1.2.7.3 免疫细胞浸润的评估
5ʹ⁃ATGGCCTTGGTCTTGATCTCC⁃ 3ʹ);mus⁃β⁃actin 本研究使用“CIBERSORTx”网站(https://ciber⁃
(F:5ʹ ⁃ TGTCCACCTTCCAGCAGATGT ⁃ 3ʹ;R:5ʹ ⁃ sortx.stanford.edu)估算了 GSE38974 样本中 22 种免
AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG⁃3ʹ)。 疫细胞的比例。
1.2.5 Western blot实验 1.3 统计学方法
收集经处理的各组细胞,4 ℃下 12 000 g 离心 使用 SPSS26.0 和 GraphPad Prism7 对实验数据
10 min 后,在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液 进行统计分析。采用 Kolmogorov⁃Smirnov 检验测量
(上海碧云天公司)中裂解 30 min。使用 BCA 蛋白 数据的正态性。符合正态分布的测量数据表示为
测定试剂盒(上海碧云天公司)测定蛋白含量。蛋 均数±标准差(x ± s),分类变量数据表示为例数(百
白质样品经 10%凝胶(上海雅酶公司)电泳后转移 分率)[n(%)]。组间比较采用χ 检验或 Fisher 确切
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到 PVDF 膜上,利用快速封闭液(上海碧云天公司) 概率法检验。若符合正态分布,对连续变量使用
对PVDF膜封闭20 min,加入抗精氨酸酶(arginase⁃1, t 检验。采用Pearson相关分析对正态分布的资料进