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第44卷第10期
               ·1338 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年10月


                  细胞衰老是细胞周期停滞的一种永久性状态，                          在心肌细胞衰老进程中的作用及可能参与的调控
              可促进发育期间和损伤后的组织重塑，但也可导致                            机制，为进一步研究瘦素调控心肌细胞衰老在心肌
              组织再生潜能和功能下降、炎症和衰老生物体内的                            微环境损伤与修复中的作用提供依据。
              肿瘤发生     ［1-2］ 。衰老细胞产生衰老相关分泌表型
                                                                1 材料和方法
             （senescence⁃associated secretory phenotype，SASP），
              通过分泌促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和                            1.1  材料
              细胞外基质降解蛋白，影响组织微环境和周围细                                  本研究所用实验细胞为小鼠心肌细胞（HL⁃1细
              胞。血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞和                            胞，目录号 GNM46，购自中国科学院细胞库），后由
              祖细胞等心血管相关衰老细胞的积累是血管老                              本实验室保存。
              化、动脉粥样硬化斑块形成、心肌梗死和心室重构                                 DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国），
              等心血管疾病的重要危险因素 。心血管疾病，                             RNA 抽提试剂盒、β⁃半乳糖苷酶（β⁃galactosidases，
                                           ［3］
              包括心肌病、心力衰竭、高血压和动脉粥样硬化，                            β⁃Gal）染色试剂盒（上海碧云天生物科技有限
              已经成为全球范围内的主要死亡原因 。衰老现                             公 司 ），逆 转 录 试 剂 盒 、SYBR Green PCR 试 剂
                                                 ［4］
              在被认为是心血管疾病发展的核心和独立危险因                             盒、γ⁃H2AX抗体（武汉Abclonal公司），实时荧光定
              素 ，它会在生物组织的多个层面上造成损伤的                             量 PCR 仪（ABI 公司，美国），PCR 引物（上海生工生
                ［5］
              积累，并诱导器官功能的普遍和破坏性下降导致                             物），重组瘦素蛋白（深圳达科为生物），SDS⁃PAGE
              不可避免的死亡。                                          凝胶配制试剂盒（上海雅酶），t⁃AKT、p⁃AKT 抗体
                  越来越多的证据表明，心脏衰老对心肌结构和                         （Santa Cruz公司，美国），t⁃PI3K、p⁃PI3K抗体（CST公
              功能的直接影响可能促进了老年人心力衰竭的发                             司，美国），PI3K抑制剂（MCE公司，美国）。
              生 。有研究报道，心力衰竭是65岁以上患者住院                           1.2  方法
                ［6］
              的最常见原因 。已有研究发现，衰老的心肌细胞                            1.2.1  细胞培养
                           ［7］
              有一些共同的生物学特性，如 DNA 损伤、内质网应                              HL⁃1 细胞在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养
              激、线粒体功能障碍、收缩功能障碍、肥厚性生长和                           基中培养，并置于 37 ℃ 5% CO2 恒温培养箱中，每
                         ［8］
              产生 SASP 等 ，损害了其功能和结构的完整性，导                        2~3 d 进行1次传代培养，实验一以5×10 个/孔接种
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              致能够发挥正常功能的心肌细胞数目减少，对心脏                            于 24 孔板中，分为对照组（Control）和瘦素刺激组
              功能产生消极影响。心肌细胞衰老是引起心功能                            （Leptin），培养 12 h 后行瘦素（10 μg/mL）刺激，再根
              下降，并导致心肌肥厚及心力衰竭等心血管疾病发                            据不同实验所需时间收集细胞。实验二将 HL⁃1
              生发展的关键因素        ［9-11］ 。                          细胞接种于 24 孔板中（1×10 个/孔），分为对照组
                                                                                           5
                  瘦素，1994 年在小鼠体内首次发现的一种约                       （Control）、瘦素刺激组（Leptin）和 Leptin+LY294002
              16 kDa 的蛋白，是一种Ⅰ型细胞因子，也是长链螺                        组，培养 18 h，用 PI3K 抑制剂（100 μmol/L）预处理
              旋细胞因子家族的成员           ［12-13］ ，主要由白色脂肪组织           2 h 后，再给予瘦素刺激 12 h 后收样，提取蛋白或
              合成和分泌，随循环系统运输到全身。此外，瘦素                            RNA用于后续实验。
              也是一种肥胖基因，通过抑制摄食作用于下丘脑中                            1.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）检测mRNA表达
              枢神经系统，调节机体能量平衡，也可以通过与瘦                                 收集各处理组 HL⁃1 细胞于 1.5 mL EP 管中，
              素受体直接结合作用于特定细胞，从而影响细胞代                            12 000 r/min 离心 5 min，弃上清后根据 RNA 抽提试
              谢 ［14］ 。近年来研究表明瘦素水平升高与感染和炎                        剂盒步骤抽提总RNA，随后参照逆转录试剂盒实验
              症过程密切相关        ［15-17］ ，而瘦素被认为是一种具有炎              步骤（每20 μL 体系含1 μg RNA 和4 μL 5×ABScript
              性功能的细胞因子样激素，具有调节免疫应答的多                            Ⅱ RT Mix）逆转录成cDNA，反应条件为：55 ℃ 15 min，
              向性作用    ［18］ 。目前已有文献报道瘦素能够调控心                     85 ℃ 5 min，cDNA产物保存于-20 ℃。qPCR测定p16、
              肌微环境中巨噬细胞的衰老              ［19］ ，另有学者发现，瘦          p21、IL⁃1β和TNF⁃α的表达，内参为β⁃actin，qPCR扩
              素可能通过激活 FAK/Src 通路，导致急性心肌梗死                       增条件为：95 ℃预变性 15 s、95 ℃变性10 s、60 ℃退
              大鼠心功能障碍，促进大鼠心肌炎症反应及心室重                            火30 s、72 ℃延伸15 s，共40个循环。p16、p21、IL⁃1β
              构 ［20］ 。关于瘦素是否能够调控小鼠心肌细胞衰老                        和TNF⁃α的mRNA相对表达量用2             -ΔΔCt 方法计算。引
              及炎症的研究尚未见报道，故本课题旨在探讨瘦素                            物序列见表1。
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