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第44卷第10期         彭明玉，刘倩颖，沈丹丹，等. 瘦素激活PI3K/AKT信号促进小鼠心肌细胞衰老的初步研究［J］.
                 2024年10月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（10）：1337-1343                      ·1339 ·


                                                                  差异有统计学意义。
                              表1 qPCR引物序列
                        Table 2 Primer sequences for qPCR
                                                                  2 结    果
                 Gene            Primer Sequence（5′→3′）
                 p16    Forward：CAATCACGGGAGGGAGCAGAG             2.1  瘦素促进小鼠心肌细胞衰老
                        Reverse：TCAGTTTCTCATGCCATTCCTTTCC             瘦素刺激小鼠心肌细胞6 h和12 h后检测衰老
                 p21    Forward：CAATCACGGGAGGGAGCAGAG             相关指标 p16、p21 和 DNA 双链损伤标志物γH2AX
                        Reverse：TCAGTTTCTCATGCCATTCCTTTCC         及炎症因子 IL⁃1β、TNF⁃α、MCP⁃1 和 IL⁃6 的表达水
                 IL⁃1β  Forward：AATGCCACCTTTTGACAGTGATG
                                                                  平，结果显示，与对照组相比，瘦素处理后p16和p21
                        Reverse：GGAAGGTCCACGGGAAAGAC
                                                                  的 mRNA 和蛋白表达增加，γ⁃H2AX 的蛋白水平亦
                 TNF⁃α  Forward：CAGCCGATGGGTTGTACCTT
                                                                  升高（P < 0.05，P < 0.01，图1A、B）；炎症因子mRNA
                        Reverse：ATAGCAAATCGGCTGACGGT
                                                                  水平明显升高（P < 0.01，图 1C）；β⁃Gal 染色显示瘦
                 β⁃actin  Forward：GGTGGGAATGGGTCAGAAGG
                                                                  素诱导后小鼠心肌细胞衰老增多（P < 0.01，图1D）。
                        Reverse：GGGGTACTTCAGGGTCAGGA
                                                                  2.2  瘦素激活小鼠心肌细胞PI3K/AKT信号通路
                1.2.3  Western blot检测蛋白表达                             瘦素刺激小鼠心肌细胞后行 Western blot 实验
                    瘦素刺激 HL⁃1 细胞后行 Western blot，检测衰               检测 PI3K/AKT 信号通路，小鼠心肌细胞经瘦素刺
                老相关指标 p16、p21 的表达及 PI3K/AKT 的磷酸化                  激 30 min 后 p⁃PI3K 和 p⁃AKT 水平明显增加（P <
                水平。收集各处理组中的HL⁃1细胞于1.5 mL EP管                      0.01，图2）。
                中，用PBS洗涤细胞1次，12 000 r/min 离心5 min，留               2.3  瘦素通过PI3K/AKT信号通路调控小鼠心肌细
                取细胞沉淀，并加入 100 μL 含 1 mmol/L PMSF 的细               胞衰老
                胞裂解液RIPA于EP管中，枪头轻轻吹打，充分重悬                             为了进一步验证 PI3K/AKT 信号通路在调控小
                细胞，并涡旋振荡3次，每次间隔5 min，充分裂解细                        鼠 心 肌 细 胞 衰 老 中 的 作 用 ，引 入 PI3K 抑 制 剂
                胞，12 000 r/min 离心 5 min，收集上清后加入 25 μL            （LY294002），如图 3A、B 所示，PI3K 抑制剂预处理
                的 5×loading buffer，于 100 ℃金属浴 8 min。各组目           后 p16、p21 的 mRNA 和蛋白表达较瘦素刺激组减
                的 蛋 白 经 12.5% SDS ⁃ PAGE 凝 胶 电 泳 后 转 移 至          少，γ⁃H2AX 的蛋白水平下调，β⁃Gal 染色结果也显
                PVDF 膜上，用 1%的牛血清白蛋白室温封闭 1 h，根                     示抑制 PI3K 磷酸化后小鼠心肌细胞衰老现象缓解
                据抗体说明书比例用一抗稀释液稀释抗体，4 ℃孵                          （P < 0.01，图3C）。
                育过夜后用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 min，用 HRP 标               2.4 瘦素促进小鼠心肌细胞分泌SASP调控自身衰老
                记的羊抗鼠（或兔）二抗室温孵育 1 h 后，TBST 洗涤                         通过 qPCR 检测 PI3K/AKT 信号通路对 SASP 分
                3 次，每次 10 min。最后涂抹发光液并置于曝光仪                       泌的影响，结果显示，IL⁃1β、TNF⁃α、MCP⁃1 和 IL⁃6
                中放射自显影显像，扫描所得条带灰度值进行半定                            在 瘦 素 处 理 后 表 达 量 增 加（P < 0.01），而 加 入
                量统计。                                              LY294002 预处理后，其表达水平降低（P < 0.05，

                1.2.4  β⁃Gal染色检测细胞衰老情况                            P < 0.01，图 4）。
                    瘦素刺激 HL⁃1 细胞 12 h 后，弃去 24 孔板内的
                                                                  3 讨    论
                培养基，用 PBS 洗涤 1 次，根据β⁃Gal 染色试剂盒实
                验步骤，每孔加入 300 μL 染色固定液，静置 15 min                       衰老是阻止肿瘤发生、限制组织损伤和促进胚
                后，用PBS洗涤3次，每次3 min，随后每孔加入300 μL                   胎发育的重要生物学过程。然而，衰老细胞一旦在
                染色工作液，37 ℃水浴箱孵育过夜，显微镜下拍照                          组织中积累，就会促进衰老相关疾病的发展                    ［21］ 。细
                观察。                                               胞衰老是一种生存程序，可由一系列破坏性应激

                1.3  统计学方法                                       （如放疗、化疗、复制应激和致癌信号）诱导。衰老
                    采用 GraphPad Prism 6.0 统计软件进行统计学               细胞的特征是稳定和不可逆的细胞周期停滞，同时
                分析，每组实验数据重复 3 次后取平均值进行统计                          保持代谢活性和活力，另外衰老细胞可激活 SASP，
                分析。各组计量结果以均数±标准差（x ± s）表示，两                       促进大量生物活性分子（如炎症介质、生长因子、细
                独立样本间比较采用 t 检验，多组间比较先进行方                          胞外基质蛋白）的合成和分泌。衰老细胞参与了重
                差分析后采用 SNK 检验进行两两比较，P < 0.05 为                    要的生理过程，如胚胎发育、免疫调节、组织再生、
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