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第44卷第11期          潘锦堃，李超普，张 许，等. miR⁃199a⁃5p在肝脏组织中的表达及其作用的初步研究［J］.
                 2024年11月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1510-1516                      ·1511 ·


                现 ［4-5］ 。在饥饿状态下，脂肪组织会进行脂肪动员，                      则，并经南京医科大学实验动物伦理委员会批准
                产生大量游离脂肪酸进入血液循环并经由肝脏吸                            （编号：1601170⁃5）。
                收，造成肝细胞内脂质积累           ［6-7］ 。                    1.1.2 试剂
                    微小非编码RNA（microRNA，miRNA）是指长度                      Hepal⁃6 细胞、AML12 细胞、质粒 pcDH⁃CD36⁃
                在 19~22 nt 的内源性 RNA，能够作为基因表达的转                    flag 获赠于复旦大学赵同金课题组。DMEM 高糖细
                录后调控因子发挥重要作用               ［8- 10］ 。在体内，前体        胞培养基、胎牛血清、Trizol（Gibco 公司，美国）、
                miRNA首先在Drosha酶的作用下被剪切，形成长度                       miRNA 加尾法逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物）、
                约70 nt的前体核苷酸分子，并通过核孔复合物运输                         miR⁃199a⁃5p⁃类似物（广州锐博生物）、Lipo2000
                至细胞质中。在细胞质中，Dicer酶对前体核苷酸分                        （Thermo Fisher 公司，美国）、Tubulin 抗体（Protein⁃
                子进行切割形成成熟的 miRNA 分子               ［11］ 。成熟的       tech 公司，美国）、脂肪酸转位酶（fatty acid translo⁃

                miRNA可以被组装到RNA诱导的沉默复合物（RNA⁃                       case，CD36）抗体（Abcam公司，英国）、FAS以及脂肪
                induced silencing complex，RISC）中 ［12］ 。在miRNA的    甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）
                种子序列的引导下，RISC被引导至靶向基因的3′非                         抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）。
                翻 译 区（3′ untranslated region，3′ UTR）并 沉 默 该       1.2  方法
                mRNA的翻译     ［11］ 。miRNA与靶基因mRNA结合后抑               1.2.1 miRNA提取及相对定量水平检测
                                                ［13］
                制其翻译，从而发挥转录后调控作用 。                                    切取 50 mg 小鼠肝脏组织加入 1 mL Trizol 并匀
                    miRNA 在肝脏脂质代谢和 NAFLD 发展阶段中                    浆；细胞样本用 PBS 冲洗 2 次，加入 1 mL Trizol 冰上
                发挥重要作用，涉及脂质代谢调节、胰岛素抵抗等                            裂解 10 min，转移至 1.5 mL 无菌无酶的 EP 管中，使
                方面  ［14- 15］ 。研究表明，多种 miRNA 的表达失调与                用氯仿抽提 RNA，并用异丙醇沉淀过夜收集总
                NAFLD 的发生密切相关，其中包括 miRNA⁃103、                     RNA，NanaDrop微量核酸测定仪进行浓度测定。
                miRNA⁃21 等表达水平增加，miRNA⁃122、miRNA⁃                     使用加尾法对总 RNA 中 miRNA 进行逆转录以
                375 等呈现下调趋势       ［16-18］ 。此外，miRNA 作为生物          获得cDNA。按照cDNA 1 mL，SYBR 5 mL，上、下游
                标志物，能够用于评估 NAFLD 的进展，为临床干预                        引物（1 mmol/L）各 2 mL，配制 RT⁃qPCR 体系，使用
                                  ［19］
                提供重要的参考依据 。                                       罗氏 Light Cycler 480Ⅱ进行 RT⁃qPCR 反应，反应程
                    已有研究表明，miR⁃199a⁃3p 和 miR⁃199a⁃5p 在            序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35个循环，
                瘦素缺陷型ob/ob小鼠肝脏中的表达水平升高 。侯                         95 ℃ 10 s，60 ℃ 3 min，40 ℃ 2 min。采用 2   -ΔΔCt 法计
                                                       ［20］
                     ［21］
                天禄等 研究发现，miR⁃199a⁃3p的过表达可以降低                      算目的基因相对 U6 核小体的相对表达水平。miR⁃
                肝细胞内甘油三酯（triacylglyceride，TAG）含量以及                199a⁃5p和U6核小体引物如下：miR⁃199a⁃5p上游引
                脂肪酸合酶（fatty acid synthesis，FAS）和固醇调节              物：5′⁃GCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC⁃3′，U6 核
                元 件 结 合 蛋 白 1（sterol⁃regulatory element binding   小体上游引物：5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′，下游
                protein 1，SREBP1）的表达水平，而使用miR⁃199a⁃3p             通用引物Poly T序列由逆转录试剂盒提供。
                抑制剂则会增加肝细胞内 TAG 含量以及 FAS 和                        1.2.2 油红O染色
                SREBP1的表达水平。miR⁃199a⁃5p在肝脏脂质代谢                        C57BL/6J小鼠高脂喂养15周后，戊巴比妥钠麻
                的作用和机制目前还不明确。本研究探究不同营养                            醉后取血处死，取出肝脏进行称重。组织冰冻切片
                状态下小鼠肝脏中miR⁃199a⁃5p的表达水平，并在肝                      后中性甲醛固定 5~10 min，清洗后加入配制好的油
                细胞中初步探索miR⁃199a⁃5p在肝细胞脂质代谢中                       红 O 工作液染色 10 min；清洗后加入苏木素染液染
                的作用和机制。                                           核1 min；超纯水清洗后显微镜观察染色结果。
                                                                  1.2.3 肝细胞转染及细胞内TAG含量检测
                1  材料和方法
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                1.1  材料                                           100 μg/mL 链霉素的 DMEM 高糖培养基于 37 ℃，
                1.1.1 动物                                          5% CO2 的环境中培养 Hepa1⁃6 细胞和 AML12 细
                    从南京医科大学实验动物中心购买 4 周龄                          胞。待10 cm皿中细胞融合度达到90%时，用0.25%
                C57BL/6J 小鼠，在 SPF 环境中普通饮食/高脂饮食                    胰酶（含 EDTA）消化细胞，六孔板的每个孔中接种
               （每组 6 只）喂养 15 周；本研究动物实验符合 3R 原                     2×10 个细胞，贴壁 16 h 后使用 Lipo2000 试剂转染
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