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第44卷第11期              何晓鑫，高俊英，郭吉超，等. Bmi⁃1基因杂合子缺失对小鼠脑老化的影响［J］.
                 2024年11月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1473-1482                      ·1475 ·


                鼠的短期空间记忆能力。实验包括适应阶段和测                             聚甲醛固定液中固定 24 h，依次在含 5%甘油的
                试阶段。在适应阶段，使用挡板将新奇臂与其他两                            0.01 mmol/L PBS、含 10%甘油的 0.01 mmol/L PBS 和
                臂隔开。将小鼠放入起始臂端，让其在起始臂和其                            含 15%甘油的 0.01 mmol/L PBS 中浸泡 12 h，随即将
                他臂中自由活动，活动时间为5 min。适应阶段完成                         标本转移至乙二胺四乙酸⁃甘油溶液（EDTA⁃glycerol，
                后，进入测试阶段。在测试阶段开始前，需移除挡板，                          EDTA⁃G）溶液中脱钙10~14 d。脱钙后的标本依次在
                使新奇臂与其他两臂连通。将小鼠依次从起始臂放                            15 g 蔗糖+92.5 mL 的 0.01 mmol/L 的 PBS+7.5 mL 甘
                入，在短期记忆正常的情况下，小鼠倾向于进入到之                           油、15 g 蔗糖+100 mL 的 0.01 mmol/L 的 PBS 和 7.5 g
                前未曾进入的臂内即新奇壁，统计小鼠在其中穿越的                           蔗糖+100 mL 的 0.005 mmol/L 的 PBS 中浸泡 12 h。
                总次数以及正确进入各臂的比例（以3次连续不重复                           然后放置于 0.01 mmol/L 的 PBS 中 4 ℃保存。固定
                进入各臂为正确的标准）。小鼠活动全程通过视频追                           好的骨组织经梯度酒精脱水并用二甲苯透明。石
                踪软件进行记录和分析。                                       蜡包埋后切片，切片厚度为 5 μm。对取材后的长
                1.2.3 Morris水迷宫                                   骨组织采用南京医科大学动物中心动物 X 射线成
                    Morris水迷宫测试是一种评估小鼠空间学习和                       像系统进行摄影。
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                记忆能力的行为学实验 ，由一个圆形水池组成，内                           1.2.6 HE染色
                壁涂有黑色油漆，水温（22±2）℃，池壁经由西北、东                            石蜡切片脱蜡后使用苏木素染液浸泡 15 min，
                北、东南、西南 4 个等距离点将水池划分为 4 个象                        流水冲洗10 min，滴加伊红染液1 min后再次流水冲
                限，在其中一象限内隐藏一直径 10 cm 的圆形白色                        洗 10 min。随后进行梯度酒精脱水，最后使用中性
                平台，平台低于水面 1 cm，池水中均匀撒入食用白                         树脂进行封片。
                色素并搅匀，使水池颜色变白。水池周围放置物品                            1.2.7 Masson染色
                作为空间参照物，供小鼠定位平台位置，训练期间                                石蜡切片脱蜡后使用 Weigert 铁苏木素染色
                物品位置保持不变。实验包括①定位航行：用于检                            5 min，流水冲洗10 min，随后使用1%酒精进行分化
                测小鼠学习和记忆的能力。训练时随机选择一个                             处理，流水冲洗直至返蓝，再使用丽春红酸性品红
                象限开始，按顺时针方向，将小鼠从各象限靠池壁                            染色液染色 5~10 min，流水冲洗 10 min。使用磷钼
                的中点位置面向池壁轻轻放入水中，并观察记录在                            酸水溶液处理 5 min 后使用苯胺蓝染液复染 5 min。
                60 s内小鼠找到平台所需的时间，为逃避潜伏期。如                         1%冰醋酸处理 1 min，流水冲洗 10 min。并进行梯
                果小鼠在60 s内未能找到隐藏的平台，则需人为引至                         度酒精脱水，最后使用中性树脂进行封片。
                平台上，停留10 s，助其记忆，此时潜伏期记为60 s，小                     1.2.8 尼氏染色
                鼠游泳速度需同时记录并分析。每个象限训练1次，                               石蜡切片脱蜡后使用0.5%尼氏染液，进行深度
                每天训练4次，连续训练6 d；②空间探索：用于检测小                        染色。随后使用去离子水和 70%的酒精进行分色
                鼠在训练寻找平台后，对平台位置的空间记忆能力。                           处理，持续20 s。并进行梯度酒精脱水，最后使用中
                第7天撤除平台，任选2个入水位置，不包括靶象限，                          性树脂进行封片。
                将小鼠面向池壁轻轻放入水中，由正上方的摄像系统                           1.2.9 免疫组织化学染色
                及电脑软件自动记录小鼠60 s内穿越平台的次数及                              对切片进行脱蜡和水化处理。随后加入以下
                靶象限运动时间百分比。                                       抗体进行孵育：PCNA（1∶1 000）、DCX（1∶1 000）、
                1.2.4 取材和切片制备                                     Caspase⁃3（1∶400）。在 4 ℃下孵育过夜后，切片用
                    小鼠麻醉后于左心室快速推注 37 ℃生理盐水                        PBS洗涤3次，每次5 min，再加入相应的兔二抗或鼠
                约50 mL，小鼠皮肤、骨组织、脑组织股骨取材后置于                        二抗（1∶2 000）在 37 ℃下孵育 1 h。然后用 PBS 洗
                装有4%多聚甲醛的EP管中，在4 ℃冰箱放置24 h，石                      涤 3 次，每次5 min。最后，用DAB显影液进行显色，
                蜡包埋切片，片厚 5 μm，标记后备用，4 ℃保存。用                       并进行脱水处理后进行封片。
                于苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色及免疫                1.2.10 蛋白印迹实验
                组织化学染色。                                               提取小鼠脑组织样本中的总蛋白，上样至 SDS
                1.2.5 股骨标本制作                                      凝胶上，电泳然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛
                    部分动物取双侧股骨作为样本，将标本上的软                          奶或 TBST 封闭 1 h 后，在 4 ℃下与以下抗体分别进
                组织剔除干净，放置在高碘酸盐⁃左旋赖氨酸⁃多                            行孵育过夜：Bmi1（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p27
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