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第44卷第5期          王诏鹤，孔秋月，丁正年. 热休克蛋白A12A对内毒素血症肝损伤的作用及机制研究［J］.
                  2024年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（5）：615-625                        ·617 ·


                限公司），山羊抗兔二抗和抗鼠二抗（Vector Labora⁃                   尾动脉加压和释压的同时检测血流信号，得出血
                tories 公司，美国），甲醛、RIPA（上海碧云天生物技                    压值。
                术有限公司），BCA蛋白定量试剂盒、TRIzol（赛默飞                      1.2.5  血气分析
                世尔科技有限公司，美国），High⁃sig ECL Western                     LPS 或 NS 作用 6 h 后，使用 1.5%异氟烷麻醉小
                blot 底物（上海天能生物科技有限公司），Apoa1、                      鼠，插管并通气，使用 iSTA T Analyzer MN：300 血气
                Apob、Apom引物（北京擎科生物科技有限公司）。相                       分析仪对左心室抽取的动脉血进行血气分析，包括
                关引物序列如下，Apoa1 上游：5′⁃GGC⁃ACGTATG⁃                  血氧分压（PO2）、血二氧化碳分压（PCO2）和血氧饱
                GCAGCAAGAT ⁃ 3′ ，下 游 ：5′ ⁃ CCAAGGAGGAG⁃           和度（SO2）。
                GATTCAAACTG⁃3′；Apob 上游：5′⁃AAGCA⁃CCTCC⁃            1.2.6  小鼠肝功能、血清脂蛋白含量检测
                GAAAGTACGTG⁃3′，下游：5′⁃CTCCAGCTCTACCT⁃                  取小鼠血液，1 500 r/min离心15 min取血清；采
                TACAGTTGA⁃3′；Apom 上游：5′⁃TAACTCCATGAAT⁃            用全自动生化分析仪检测小鼠血清丙氨酸氨基转
                CAGTGCCCT⁃3′，下游：5′⁃CCCGCAATAAAGTAC⁃               移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨
                CACAGG⁃3′。过表达Hspa12a的腺病毒及阴性对照                     基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、高密度
               （上海吉凯生物科技有限公司）。                                    脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein cholesterol，

                1.2  方法                                           HDL⁃C）和低密度脂蛋白胆固醇（low⁃density lipopro⁃
                1.2.1  生物信息学分析                                    tein cholesterol，LDL⁃C）水平。
                    应用GEO数据库，获得盲肠结扎穿孔所致脓毒                         1.2.7 组织学分析
                症小鼠及假手术小鼠肝脏的 mRNA 标准化表达水                              LPS 或 NS 作用 6 h 后，取小鼠肝和肠组织用
                平（n=3），使用 GraphPad Prism 8 制作直方图，使用               10%福尔马林固定，制备石蜡切片，进行苏木素⁃伊
                R 软件制作聚类热图以及火山图。火山图差异基因                           红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色，通过显微镜观察分
                筛选标准为P < 0.01且|log2FC| > 2。                       析结果。每个样本选取 6 个视野，进行肝和肠组织
                1.2.2  内毒素血症小鼠模型建立                                损伤程度评分及肝组织炎症病灶数量统计。肠组
                                      -/-
                    WT 小鼠和 Hspa12a 小鼠分别腹腔注射 LPS                   织损伤程度根据Chiu’s评分标准             ［14］ 进行评分，具体
               （5 mg/kg）或生理盐水（normal saline，NS），将小鼠分              评分标准如下：肠黏膜、绒毛正常（0 分）；在绒毛顶
                                        -/-                       端中出现肠黏膜上皮下间隙扩大，常伴有毛细血管
                为 NS⁃WT 组、NS⁃Hspa12a 组、LPS⁃WT 组和 LPS⁃
                Hspa12a 组。注射后6 h进行相应检测和分析。                        充血，炎症细胞浸润（1 分）；肠上皮下间隙显著扩
                       -/-
                1.2.3  小鼠体温检测和活动评分                                张，绒毛顶端上皮与固有层中度分离（2分）；固有层
                    LPS（5 mg/kg）作用 0、2、4 和 6 h 后使用直肠探             大量分离，部分绒毛顶端脱落（3 分）；绒毛及固有
                头检测小鼠体温。同时在上述时间段内按照文中                             层脱落，毛细血管扩张（4 分）；固有层破坏，伴出血
                所描述的方法进行动物活动评分                ［13］ 。观察小鼠在         或溃疡（5 分）。肝组织损伤程度根据参考文献所
                2 min 内的姿势和活动，4 分（正常）：小鼠没有出现                      述标准进行评分        ［15］ ：正常肝组织（0分）；肝窦充血水
                驼背姿势，有自发的快速活动，期间穿插着进食和                            肿（1 分）；肝细胞胞浆空泡化（2 分）；肝脏组织点状
                饮水；3 分（轻度）：出现偶尔且短暂（5~10 s）的驼背                     坏死伴中央静脉炎性细胞浸润（3 分）；肝脏实质细
                姿势，能够自然恢复正常，并且有自发的快速活动，                           胞片状坏死（4分）。采用Image J软件对肝组织炎症
                穿插着进食和饮水；2 分（轻中度）：出现较长时间                          病灶数量及组织面积进行统计。
               （>20 s）的驼背姿势，能够自然恢复正常，并伴有持                         1.2.8  原代肝细胞分离提取、培养及处理
                续自发的快速活动，穿插着进食和饮水；1 分（中重                              使用本课题组先前所描述的方法从 6~8 周龄
                度）：持续驼背，只有在受到强烈外部刺激时才会活                           WT鼠中分离原代肝细胞           ［16］ 。用Hank’s缓冲盐溶液
                动；0 分（重度）：持续驼背，不活动。如果小鼠观察                         通过门静脉原位灌注肝脏，然后使用 0.06%的Ⅳ型
                期间内出现两种状态，则使用0.5分作为间隔。                            胶原酶灌注消化肝脏。收集肝脏消化物并以 50 g

                1.2.4  血压测量                                       离心3 min，将含有肝细胞的沉淀重悬后铺在有胶原
                    LPS 或 NS 作用 6 h 后使用 ALC⁃NIBP 无创血压             包备的细胞培养板上。肝细胞在含有 10%胎牛血
                测量仪系统测量小鼠收缩压（systolic blood pressure，             清的 DMEM 中培养 16 h 后，进行 Hspa12a 或阴性对
                SBP）。将传感器套在小鼠尾部，通过充气、放气对                          照（NC）腺病毒转染，24 h后使用LPS（500 ng/mL）或
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