Page 30 - 南京医科大学自然版
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第44卷第5期
               ·618 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年5月


              等量NS作用6 h，收取细胞培养上清进行检测。                           腹腔注射诱导小鼠内毒素血症模型，结果显示 LPS
              1.2.9  蛋白免疫印迹实验                                  （5 mg/kg）作用6 h后小鼠出现活动减弱（P < 0.001）、
                  取小鼠30 mg肝组织，加入含有研磨珠和0.3 mL                    体温降低（P < 0.001）、血SO2降低（P < 0.01）、血PO2
              RIPA 溶液的研磨管中，放入研磨机充分研磨，冰上                         降低（P < 0.01）和 SBP 降低（P < 0.01），而血 PCO2增
              裂解 30 min，收集总蛋白质，使用 BCA 法测定蛋白                     加（P < 0.05，图 1A~F）。组织病理学结果显示，LPS
              浓度；取等量蛋白质凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶                           引起了肠和肝的组织损伤评分显著升高（图 1G、
              室温封闭 2 h；等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤膜 3 次，                    H）。以上结果表明LPS（5 mg/kg）处理6 h诱导小鼠
              7 min/次，加入一抗4 ℃孵育过夜；TBST洗涤膜3次，                    内毒素血症模型成功。
              7 min/次；室温加入二抗孵育1 h；TBST 洗涤膜3次，                   2.2 HSPA12A在内毒素血症小鼠肝组织中表达降低

              7 min/次；将 ECL 显影剂均匀滴至膜上，并通过 ECL                        课题组前期研究表明 HSPA12A 可减轻内毒素
              发光仪进行显影处理。                                        所致的肺损伤       ［11］ ，为了明确HSPA12A是否与内毒素

              1.2.10  RT⁃PCR                                    血症所致肝损伤有关，本研究首先采取公共数据库
                  按照先前报道的方法          ［10］ ，取60 mg肝组织，使用         中的GEO数据集（GSE160380），在该RNA测序数据
              TRIzol 试剂提取组织内的总 mRNA，随后逆转录成                      中提取 22 种热休克蛋白的 mRNA 表达数据。如图

              cDNA。使用SYBR Green Master 通过荧光定量PCR                2A 所示，与假手术组比较，盲肠结扎穿孔诱导的脓
              检测基因的表达水平。                                        毒症组小鼠的4个热休克蛋白表达下降、1个表达增
              1.2.11 临床资料收集                                     加、17个表达不变。其中，Hspa12a的mRNA表达显
                  纳入南京医科大学第一附属医院2023年12月—                       著下降。
              2024年3月住院成年患者共30例，其中确诊为脓毒                              为进一步明确 HSPA12A 蛋白在内毒素血症肝
              症肝功能损伤的患者15例，未确诊为脓毒症肝功能                           组织中的表达变化，采用革兰氏阴性菌细胞壁的主
              损伤且年龄和性别相匹配的患者 15 例作为对照                           要致病成分 LPS 诱导内毒素血症模型，于 LPS 作用
              组。通过数字化病案管理系统回顾性查阅患者的                             6 h 后收集肝组织进行免疫印迹分析。结果显示，
              临床资料并准确录入其相关临床数据。纳入标准：                            LPS⁃WT组小鼠肝组织中HSPA12A蛋白水平较NS⁃WT
              ①符合脓毒症 3.0 诊断标准          ［17］ ，即可疑感染且序贯           组显著下降（图2B，P < 0.05）。
              器官衰竭评分≥2.0 分；②符合脓毒症肝损伤诊断                          2.3  Hspa12a基因敲除加重内毒素血症肝损伤
              标准，即至少符合以下 1 个方面：ALT 升高 1 倍或                           为了进一步明确 HSPA12A 在内毒素血症所致
              AST 升高 1 倍。排除标准：① 肝脏肿瘤或肝脏部分                       肝损伤中的作用，本研究采用前期构建的Hspa12a                    -/-
              切除；②中毒、药物损伤等非脓毒症导致的肝损伤；                           小鼠，通过免疫印迹分析证实 HSPA12A 在肝脏中
              ③既往存在慢性肝病如酒精性肝病等；④本次入住                            不表达（图 3A）。随后采用 Hspa12a 和 WT 小鼠，
                                                                                                 -/-
              ICU因急性肝病或慢性肝病急性发作；⑤胆道疾病，                          分别给予 LPS 和 NS 腹腔注射，6 h 后采集血清，测
              梗阻性黄疸。本研究经南京医科大学第一附属医                             定其中肝脏损伤标志物 ALT 和 AST 的活性水平。
              院伦理委员会批准（伦理号：2022⁃SR2⁃149）。                       结果如图 3B 所示，与 NS 组比较，LPS 显著升高 WT
                                                                            -/-
              1.3  统计学方法                                        鼠和 Hspa12a 鼠的ALT（P < 0.05，P < 0.001）和AST
                  采用 GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析，               （P < 0.01，P < 0.001）水平，而与 LPS⁃WT 组比较，
              符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差 （x ± s） 表                    LPS⁃Hspa12a 组小鼠ALT（P < 0.01）和AST（P < 0.05）
                                                                            -/-
              示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采                           水平进一步升高。此外，小鼠肝组织 HE 染色结果
              用方差分析；非正态分布的连续性变量采用中位数                            显示，LPS使肝组织损伤评分显著升高（P < 0.001）、
             （四分位数）［M（P25，P75）］进行描述，两组间比较采                      炎症病灶数量显著增加（P < 0.001），而与 LPS⁃WT
              用Mann⁃Whitney检验。定性资料用频数表示，采用                      组比较，LPS⁃Hspa12a 组小鼠肝组织损伤评分更高
                                                                                   -/-
              卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。                          （P < 0.05），炎症病灶数量更多（P < 0.01，图3C~E）。

                                                                2.4  Hspa12a基因敲除降低内毒素血症小鼠肝脏载
              2 结 果
                                                                脂蛋白mRNA表达水平
              2.1  LPS诱导小鼠内毒素血症                                      考虑到脂质代谢在内毒素血症中发挥重要作
                  采用革兰氏阴性菌细胞壁的主要致病成分LPS                         用 ［4］ ，本研究采用公共数据库中的 GEO 数据集
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