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第44卷第5期             曾   强，张在奎，孙乃双，等. TBK1对NLRC4炎症小体的作用及其机制研究［J］.
                  2024年5月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（5）：595-603，614                     ·597 ·


                Anti⁃Caspase⁃1（AdipoGen 公司，美国），Anti⁃p⁃Ser         器过滤后，转移至 15 mL 离心管内，1 500 r/min离心
               （Santa 公司，美国），Anti⁃TBK1（CST 公司，美国），                5 min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬，静置 5 min
                Anti⁃p⁃TBK1（武汉 ABcolond 公司），Anti⁃GAPDH            后，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，用 1 mL 含 10%
               （Proteintech 公司，美国）；Cy3 标记的山羊抗兔 IgG                血清的DMEM完全培养基重悬骨髓细胞，将细胞混
                                                                                   2
               （H+L）、FITC 标记的山羊抗鼠 IgG（H+L）（Jackson                悬液加入至 25 cm 培养瓶中，随后加入含有 1 mL
                ImmunoResearch，美 国 ），HRP 标 记 的 山 羊 抗 兔            L929 细胞培养上清、2.5 mL Cre⁃J2 细胞培养上清、
               （H+L）、HRP 标记的山羊抗鼠（H+L）（北京中杉金                       5 μL 浓度为 8 mg/mL 的 Polybrene 和 500 μL 完全培
                桥公司），APC⁃CD11b、PE⁃Ly6G（eBioscience 公司，            养基的诱导培养基，于 37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中
                美国）。                                              培养，隔天更换诱导培养基，5 d 后，使用完全培养

                    质粒：pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃           基继续培养细胞，直到细胞增殖，获得 IBMDM。
                TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃TBK1⁃N 端、pcDNA3.3⁃Myc⁃          1.2.2 shTBK1敲减实验
                                                                                        TM
                TBK1⁃C 端、pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1Ser172A、pcDNA3.1⁃          在室温下，将 PolyJet Reagent 转染试剂（3 μL）与
                Flag⁃TBK1Ser172D、pgex6p1⁃GST⁃TBK1、pet28a⁃HIS⁃     1 000 ng/μL 的 shTBK1（1 μL）混 合 于 100 μL 的
                NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃     DMEM 中并静置 15 min，随后滴加到 RAW264.7 细
                NLRC4⁃ΔCARD、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃NACHT、             胞中，37 ℃继续培养48 h。

                pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃LRR、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4         1.2.3 S.T菌株SL1344的培养及刺激方法
                Ser533A、pc⁃DNA3.3⁃Myc⁃NLRC4 Ser533D 由本实验              在无菌 15 mL 离心管中，用 5 mL LB 液体培养
                室构建。pcDNA3.1⁃Flag⁃NLRC4、pet28a⁃LFN ⁃FLIC          基（无抗生素）于 37 ℃培养 S.T 菌株 SL1344 12 h。
                由北京生命科学研究院邵峰实验室赠送。shTBK1                          1∶100比例稀释菌液，于37 ℃继续培养3 h。随后吸
                由本实验构建。                                           取1 mL菌液，在室温下，5 000 r/min离心5 min，弃上
                    S.T 菌株 SL1344，小鼠胚胎成纤维细胞 Cre⁃J2、               清，用2 mL无菌PBS重悬。吸取 S.T菌株SL1344悬
                小鼠成纤维细胞L929、人胚胎肾细胞HEK293T和小                       液（MOI：50）滴加到待刺激的 IBMDM 或 RAW264.7
                鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自美国模                         细胞中，混匀，37 ℃刺激2 h后收集细胞培养上清以
                式培养物集存库（American type culture collection，         及细胞裂解液备用。
                ATCC），IBMDM为本实验室保存。                               1.2.4 LDH检测
                    6~8 周龄的 C57BL/6 雄性小鼠由南京医科大学                       收 集 S.T（MOI：50）刺 激 后 的 IBMDM 或
                实验动物中心提供。动物实验严格遵循实验动物                             RAW264.7细胞培养上清，400 g离心5 min。按LDH
                饲养及操作规范，由南京医科大学实验动物福利伦                            检测试剂盒操作说明检测。
                理委员会审核（IACUC⁃2003010）。                            1.2.5 Western blot实验
                1.2  方法                                               通过 RIPA 裂解缓冲液（0.225 mol/L Tris⁃HCl、
                1.2.1 骨髓巨噬细胞的分离与IBMDM的诱导                          50%甘油、5%SDS和0.05%溴酚蓝）或Loading buffer
                    提 前 将 Cre ⁃ J2 细 胞 复 苏 ，用 含 20% 血 清 的         从 IBMDM、RAW264.7或HEK293T细胞中提取总蛋
                DMEM在75 cm 细胞培养瓶中培养。待铺满75 cm 细                    白。BCA法用于检测蛋白质浓度。每个样品取20 μg
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                胞瓶且培养 48 h 后收细胞上清，使用 0.45 μm 滤器                   蛋白质进行 SDS⁃PAGE 分离，然后转移到 PVDF 膜
                进行过滤，细胞上清冻存于-80 ℃，备用 。将 L929                      上。5%脱脂牛奶封闭后，使用相应的一抗（Caspase⁃1、
                细胞复苏，使用含 10%血清的 DMEM 在 75 cm 细胞                   GSDMD、GAPDH、p⁃TBK1、p⁃NLRC4 等）在4 ℃下孵
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                培养瓶培养 7 d 后，收细胞上清，使用 0.45 μm 滤器                   育过夜，室温下相应二抗孵育 1 h。通过化学发光
                过滤，细胞上清冻存于-80 ℃，备用。                               试剂和化学发光成像系统获得图像。
                    C57BL/6 小鼠麻醉后脱臼处死，75%乙醇消毒                     1.2.6 S.T鞭毛毒力蛋白FLIC的制备和纯化
                小鼠皮肤 3 min。在超净台中取出双下肢的胫骨及                             将质粒pet28a⁃LFN⁃FLIC转化到大肠杆菌BL21

                股骨，使用 75%乙醇浸泡消毒 30 s，移入 4 ℃ 1×PBS                 中培养，37 ℃过夜。挑取单克隆菌落于液体LB培养
                中浸泡，剪去骨头两端，暴露骨髓腔，使用 1 mL 注                        基中，37 ℃下振荡过夜。将细菌溶液以1∶100的比例
                射器吸 4 ℃ RPMI 1640 培养基将骨髓从股骨、胫骨                    接种到 LB 中，37 ℃下培养。当 D（600 nm）为 0.5~
                中吹出，反复吹打，使细胞团块分散，使用 70 μm 滤                       0.7 时，将 0.5 mmol/L 异丙基β⁃D⁃1⁃硫代吡喃半乳糖
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