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第44卷第5期             曾   强，张在奎，孙乃双，等. TBK1对NLRC4炎症小体的作用及其机制研究［J］.
                  2024年5月                    南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（5）：595-603，614                     ·599 ·


                对照组与实验组，对照组用1×PBS灌胃预处理7 d，实                      （FLIC）刺激 IBMDM 也显示相同的结果（图 1E、F）。
                验组用 25 mg/kg AML 灌胃预处理 7 d，通过腹腔注                  为了进一步确认TBK1对NLRC4炎症小体诱导的细
                射不同浓度的S.T 来感染小鼠以检测小鼠生存率及                          胞焦亡的作用，分别检测在S.T或FLIC刺激下，IBM⁃
                相关炎症指标等。                                          DM 和 RAW264.7 的细胞培养上清中的 LDH 含量，
                    取对照组和实验组小鼠各5只，每只小鼠腹腔内                         结果显示，抑制 TBK1 降低了 IBMDM 和 RAW264.7
                注射1×10 CFU的S.T，观察和记录小鼠死亡时间。                       细胞培养上清中 LDH 的含量（图 1G、H、I）。在
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                    取对照组和实验组小鼠各 3 只，每只小鼠在腹                        RAW264.7 细胞中采用shRNA敲减TBK1，同样观察
                腔内注射1×10 CFU的 S.T，感染24 h。依次收集小                    到敲减 TBK1 可以抑制 Caspase⁃1 和 GSDMD 的剪切
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                鼠的血清、腹腔灌洗液、肺脏。炎症因子检测：小鼠腹                         （图1J、K）以及LDH的释放（图1L）。以上数据表明，在
                腔灌洗液在 4 ℃下 1 500 r/min 离心 10 min，收集上              巨噬细胞中，TBK1参与调控NLRC4炎症小体的活化。

                清，ELISA 试剂盒检测血清及腹腔灌洗液中的IL⁃1β                      2.2  TBK1与NLRC4相互作用
                和TNF⁃α含量。细菌负荷量检测：将肺脏称重，并置于                            有研究报道NLR家族中的NLRP3与TBK1具有
                含有1 mL无菌 1×PBS 1.5 mL 离心管中利用组织研                   相互作用，而NLRC4与NLRP3具有高度相似的结构，
                磨仪进行组织研磨（60 Hz，2~5 min）。 按梯度稀释                    同样包括NACHT与LRR结构域，所以推测NLRC4与
                法稀释得到组织匀浆，取 200 μL 稀释后的混合液，                       TBK1 可能也存在相互作用。在 HEK293T 细胞中

                涂板，将平板置于 37 ℃过夜，拍照、计数统计小鼠S.                       过量表达 Flag⁃NLRC4、Myc⁃TBK1，Co⁃IP 结果表明
                T 感染后肺脏的细菌负荷量，同法统计腹腔灌洗液                           NLRC4 与 TBK1 具有相互作用（图 2A、B）。为进一
                中的细菌负荷量。中性粒细胞比例检测：取小鼠腹                            步确定二者是否有直接相互作用，使用纯化的HIS⁃
                腔灌洗液 4 ℃下 1 500 r/min 离心 10 min，收集细胞              NLRC4 以及 GST⁃TBK1 蛋白，进行 GST pull⁃down 实
                沉淀，向细胞沉淀加入 2 mL 红细胞裂解液重悬裂                         验，结果显示，NLRC4与TBK1具有直接的相互作用
                解 2 min，并加入 8 mL 1×PBS 终止裂解，并在 4 ℃               （图2C、D）。并且，在HEK293T细胞中过量表达Flag⁃
                1 500 r/min离心10 min，弃上清。用 200 μL 1×PBS 重          TBK1、Myc⁃NLRC4，免疫荧光实验结果显示TBK1与
                悬，滤网过滤后，加入含有 APC⁃CD11b、PE⁃Ly6G抗体                  NLRC4在空间上共定位（图 2E）。为了确定 TBK1
               （1∶400）的混合液重悬，冰上孵育 30 min。孵育结束                     与 NLRC4 相互作用的具体结构域，构建了一系列
                后，在1.5 mL EP 管中加入 200 μL 1×PBS 漂洗抗体，              TBK1 与 NLRC4 的截短体，并通过 Co⁃IP 实验证明
                3 000 r/min 4 ℃离心 7 min，弃上清，使用 400 μL 1×          了 TBK1 的 N 端与 NLRC4 的 NACHT 结构域存在相
                PBS 重悬，流式细胞仪检测腹腔灌洗液中的中性粒                          互作用（图2F、G）。并且发现影响TBK1的激酶永久
                细胞比例。                                             活性形式（Ser172D）和永久非活性形式（Ser172A）都
                1.3  统计学方法                                        不会改变 TBK1 与 NLRC4 的相互作用（图 2H），表
                    统计学分析及相关绘图通过 GraphPad Prism                   明 TBK1 的激酶活性不影响其与 NLRC4 的相互
                7.0软件实现。所有实验数据以均数±标准差（x ± s）                      作用。以上结果表明 TBK1 可以和 NLRC4 相互
                表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较                           作用。
                采用单因素方差分析，Kaplan⁃Meier 方法分析小鼠                     2.3 TBK1影响ASC寡聚物的形成
                死亡率。P < 0.05为差异有统计学意义。                                激活 NLRC4 炎症小体会诱导 ASC 在内的大分

                                                                  子复合物组装，活化的NLRC4与ASC结合并与ASC
                2  结 果
                                                                  斑点共定位。为了检验TBK1是否影响炎症小体组
                2.1  TBK1参与调控NLRC4炎症小体激活                          装，检测抑制 TBK1 对 NLRC4 炎症小体的 ASC 斑点
                    为了检测TBK1是否参与调控NLRC4炎症小体                       形成的影响。实验结果显示，与 S.T 组相比，TBK1
                的活化，使用 TBK1 抑制剂（GSK8612）预处理小鼠                     抑制剂 GSK8612 处理组的 ASC 斑点明显减少（图
                IBMDM 细胞，在 S.T 刺激作用下，抑制 TBK1 可导致                  3A），同时其 ASC 寡聚物也显著降低（图 3B）。以上
                Caspase⁃1和GSDMD剪切条带明显减少（图1A、B）；                   数据表明抑制 TBK1 可以减少 ASC 寡聚体形成，影

                在S.T感染的RAW264.7中，同样观察到，抑制TBK1                     响ASC⁃NLRC4复合体的组装。
                可以抑制 Caspase⁃1 和 GSDMD 的剪切（图 1C、D）。               2.4 TBK1磷酸化NLRC4 Ser533位点
                使用制备的 NLRC4 特异性激动剂 S.T 鞭毛蛋白                           已有研究表明，NLRC4的第533位丝氨酸的磷酸
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