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第44卷第5期
·598 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年5月
苷（IPTG）加入到细菌溶液中，并在 22 ℃下诱导表 检测 TBK1 的酶活性是否影响与 NLRC4 的相
达 12 h。 4 ℃ 3 000 r/min 离 心 20 min 后 收集菌 互作用：将 pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1、pcDNA3.1⁃Flag⁃
体。超声波裂解后，按照 HIS 标签蛋白纯化试剂盒 TBK1Ser172A、pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1Ser172D、pcD⁃
的说明获得纯化的FLIC蛋白。 NA3.3⁃Myc⁃NLRC4在 HEK293T中过表达16 h，Co⁃IP
1.2.7 毒力蛋白激活NLRC4炎症小体 方法同上，后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃Myc及相应
在室温下，将 PolyJet Reagent 转染试剂（3 μL） 二抗进行Western blot检测。
TM
与含有 5 μg/mL 的 FLIC 蛋白溶液（20 μL）混合于 检测NLRC4 Ser533位点的磷酸化水平是否影响
100 μL DMEM中并静置15 min，随后滴加到IBMDM 与TBK1的作用：将pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃
细胞中，37 ℃继续培养 24 h。收集细胞培养上清， Myc ⁃ NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4 Ser533A、
使用 Loading buffer 裂解细胞，收集细胞裂解液，进 pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4 Ser533D在 HEK293T中过表
行Western blot检测，方法同1.2.5。 达 16 h，Co⁃IP 方法同上，后续加入一抗 Anti⁃Flag、
1.2.8 重组 GST⁃TBK1 及 HIS⁃NLRC4 蛋白的制备、 Anti⁃Myc及相应二抗进行Western blot检测。
纯化及GST pull⁃down 1.2.10 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）实验
将含有 TBK1 和 NLRC4 的重组质粒 pgex6p1⁃ 为了检测TBK1是否磷酸化NLRC4，将pcDNA3.1⁃
GST⁃TBK1、pet28a⁃HIS⁃NLRC4 转化到大肠杆菌 Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃Myc⁃
BL21中。使用0.1 mmol/L IPTG在20 ℃下诱导重组 NLRC4 Ser533A在 HEK293T中过表达16 h后，用含
蛋白GST⁃TBK1表达12 h；0.5 mmol/L IPTG诱导HIS⁃ 有 1%蛋白酶抑制剂 PMSF 的 RIPA 缓冲液裂解细
NLRC4 表达14 h。按照GST标记蛋白质纯化试剂盒 胞，4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min，收集上 清。加入
或 HIS 标记蛋白质纯化试剂盒提供的说明进行纯 Anti⁃Myc抗体，4 ℃过夜，加 入蛋白 A/G 磁珠混合 1 h，
化。将纯化的蛋白质混合在同一离心管中，孵育过夜 然后用 1×PBST（含有 1% TritonX⁃100）洗涤磁珠3次，
后，加入镍柱或谷胱甘肽磁珠混合2 h，再用1×PBST 将 IP 样品用 2×Loading buffer 重悬，并 95 ℃煮沸
（含有1% TritonX⁃100）洗涤磁珠3次以去除抗原非特 5 min，后续加入Anti⁃p⁃Ser、Anti⁃p⁃NLRC4、Anti⁃Myc、
异性结合，样品用2×Loading buffer重悬，并在95 ℃下 Anti⁃Flag及相应二抗进行Western blot。
煮沸5 min，进行Western blot检测，方法同1.2.5。 1.2.11 细胞免疫荧光
1.2.9 免疫共沉淀（co⁃immunoprecipitation，Co⁃IP） S.T（MOI：10）刺激后的 IBMDM，用 1×PBS 洗涤
实验 3 次，4%多聚甲醛室温固定 15 min，在 0.02% NP⁃40
检测TBK1是否与NLRC4相互作用：将pcDNA3.1⁃ 中通透 10 min，使用快速封闭液封闭 15 min，并用
Flag⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃ Myc⁃TBK1 在 HEK293T 中 Anti⁃ASC 抗体（1∶100）孵育过夜。荧光标记的二抗
过表达 16 h。然后用含有 1%蛋白酶抑制剂 PMSF （FITC 标记的山羊抗鼠 IgG）室温避光孵育细胞
的 RIPA 裂解液裂解细胞，4 ℃下以 12 000 r/min 离 60 min，DAPI复染，通过荧光显微镜观察。同法处
心10 min，收集上 清。加入Anti⁃Myc或Anti⁃Flag 抗 理过表达 TBK1 及 NLRC4 的 HEK293T 细胞，加入
体，4 ℃下过夜，加 入蛋白 A/G 磁珠混合 1 h，然后 Anti⁃Flag、Anti⁃Myc抗体（1∶100）及相应二抗孵育后，
用 1×PBST（含有 1% TritonX⁃100）洗涤磁珠 3 次，将 荧光显微镜观察。
Co⁃IP 样品用 2×Loading buffer 重悬，并 95 ℃煮沸 1.2.12 ASC寡聚化实验
5 min。后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃Myc 及相应二 将 IBMDM 铺于细胞孔板中，待其密度达到
抗进行Western blot检测。 50%，使用S.T菌株（MOI：10）刺激细胞2 h，4 ℃ 裂解
检测TBK1与NLRC4的结合区域：将pcDNA3.1⁃ 细胞30 min。收集细胞悬液，离心取上清备用。 剩
Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃Myc⁃ 余细胞沉淀加入 1×PBS 重悬，加入 DSS 交联剂充分
NLRC4⁃ΔCARD、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃NACHT、 混匀，室温静置后离心，弃上清，加入 Loading buffer
pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃LRR；pcDNA3.3⁃ Myc⁃TBK1、 煮样。所有样品进行 Western blot 检测，加入一
pcDNA3.3⁃Myc⁃TBK1⁃N 端、pcDNA3.3⁃Myc⁃TBK1⁃C 抗 Anti⁃ASC 及相应二抗孵育。通过化学发光试剂
端、pcDNA3.1⁃Flag⁃NLRC4 在 HEK293T 中过表达 和化学发光成像系统获得图像。
16 h，Co⁃IP方法同上，后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃ 1.2.13 S.T感染小鼠模型构建及相关炎症指标检测
Myc、Anti⁃TBK1及相应二抗进行Western blot检测。 将野生型（wild type，WT）C57BL/6 小鼠分为
