Page 68 - 南京医科大学自然版
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第44卷第6期
               ·804 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年6月


              1.2.4 共识聚类分析                                      PneumaCult ⁃ ALI Medium 培养基、每 2 d 换液，第
                                                                          TM
                  根据 22 个 MRG 表达谱，对 289 例哮喘患者样                  21 天于下室予 10 ng/mL 白介素（interleukin，IL）⁃13
              本进行无监督聚类分析；根据一致聚类结果，确定                            刺激，动态观察小鼠气道上皮形成及形态变化。
              最佳聚类数。                                            1.3  统计学方法
              1.2.5 富集分析与加权基因共表达网络分析                                 统计分析由 R 软件（版本 4.3.1）及 GraphPad
                  采用基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因                Prism 9 软件处理，数据使用均数±标准差（x ± s）表
              与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and          示，不同分组间的比较采用t检验。P < 0.05为差异
              genomes，KEGG）通路分析法对不同哮喘亚型 DEG                     有统计学意义。
              进行富集，使用WGCNA识别每个亚型的核心基因。
                                                                2  结 果
              1.2.6 潜在小分子药物鉴定
                  选取各亚型核心基因与DEG交集基因，将差异                         2.1  哮喘气道中线粒体自噬失调

              倍数最大的前 150 个上调与下调基因输入至 cMap                            GSE76226、GSE63142 及 GSE67472 气道上皮刷
              数据库中，药物评分范围为-100~100，评分越低表                        检样本数据集分析结果示，相比健康受试者，哮喘
              明该药物在相应哮喘亚型治疗方面的潜力越大。                             患 者 MRG 整 体 表 达 显 著 上 调（ 图 1A、B）；
              1.2.7 急性哮喘小鼠模型构建                                  GSE179156数据集进一步验证了该结果（图1C）；火
                  SPF 级 6~8 周龄 BALB/c 小鼠适应性喂养后，随                山图显示，MRG 中共富集出 8 个 DEG，其中 1 个下
              机分为哮喘组和对照组。哮喘组第0、7、14天腹腔注                         调［自噬接头受体蛋白 1（sequestosome 1，SQSTM1/
              射2 mg/kg 鸡卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）+80 mg/kg           p62）］，7 个 上 调［TOMM5、FUN14 结 构 域 蛋 白 1
              氢氧化铝进行致敏，第20、21、22天鼻内滴注4 mg/kg                   （FUN14 domain containing 1，FUNDC1）、线粒体外
              OVA 进行激发；对照组 PBS 代替，处理方式同上。                       膜转位酶 22（translocase of outer mitochondrial mem⁃
              各组小鼠末次激发后次日取小鼠肺组织进行后续                             brane 22，TOMM22）、泛素⁃核糖体结合蛋白 52（ubiq⁃
              相关实验，所有小鼠麻醉后迅速进行操作。                               uitin A ⁃ 52 residue ribosomal protein fusion product，
              1.2.8 免疫组化                                        UBA52）、线粒体融合蛋白2（mitofusin⁃2，MFN2）、泛
                  SPF 级 6~8 周龄 BALB/c 小鼠肺组织石蜡标本                 素 B（ubiquitin B，UBB）、磷酸甘油酸变位酶 5（phos⁃
              切片，经脱蜡、水化、高压热修复后，3% H2O2 灭活                       phoglycerate mutase 5，PGAM5），图1D］。
              内源性过氧化物酶，室温孵育 15 min，PBS 冲洗 3 次                   2.2  TOMM5免疫组化验证
             （5 min/次）；10%山羊血清封闭，室温孵育1 h，甩干，                         通过分析比较哮喘患者与健康个体间的MRG，
              滴加线粒体外膜转位酶 5（translocase of outer mito⁃           选取统计学差异最为显著的DEG即TOMM5进行后
              chondrial membrane 5，TOMM5）多克隆抗体（25607⁃1          续验证。
              ⁃AP，上海Proteintech公司），4 ℃过夜；室温下PBS冲                     小鼠肺组织免疫组化结果显示，气道上皮细胞
              洗3次（5 min/次），滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，                     表达 TOMM5，且 OVA 激发的哮喘小鼠气道上皮
              室温孵育 1 h；PBS 冲洗 3 次（5 min/次），显微镜下                 TOMM5 表达显著高于对照组（图 2A），与分析结果
              DAB着色，蒸馏水充分洗涤；依次以苏木素复染40 s、                       一致。
              蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明化、中性树                                ALI 模型观察小鼠气道上皮形成及形态变化，
              胶固定封片；最后显微镜下观察，出现棕黄/褐色视                           发现IL⁃13可显著上调小鼠原代气道上皮细胞中的
              为阳性染色。                                            TOMM5蛋白水平（图2B）。
              1.2.9 气液交界（air⁃liquid interface，ALI）模型            2.3  预测模型的建立和评估
                  C57BL/6 乳鼠处死后酒精消毒，剪 T 字形切口、                        基于基因表达数据与疾病状态或表型间的关
              镊子取出肺组织，消化后提取原代肺球细胞。收集                            联程度及基因间的相关性、冗余性、模型的预测性
              培养约2周的肺球，离心后加入消化酶解离，再次离                           能等，运用多种机器学习算法（包括随机森林、逐步
              心弃上清液、加入 PneumaCult ⁃Ex Plus Medium 培             回归和多变量Logit模型）对22个MRG进行分析，根
                                         TM
              养基重悬，调整密度接种至 Transwell 小室上室，下                     据多种因素综合考虑，筛选出与疾病最相关的 7 个
              室加入适量培养基，置于细胞培养箱（37 ℃、5%                          特 征 基 因 TOMM5、FUNDC1、TOMM22、SQSTM1、
              CO2）培养；细胞长满上室后，仅于下室加入适量                           PGAM5、MFN2、核糖体蛋白 S27a（ribosomal protein
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