Page 8 - 南京医科大学自然版

第44卷第7期
·892 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年7月

and reduced the levels of key molecules for Ca 2 + transfer between MAM（P < 0.05）. Meanwhile，putrescine improved mitochondrial
function（P < 0.05）and reduced intracellular ROS levels（P < 0.001）by alleviating mitochondrial calcium overload（P < 0.001）caused
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by rapid Ca transfer between MAMs. Conclusion：The addition of putrescine to in vitro maturation cultures significantly improved the
quality of oocytes of aged mice. Putrescine also alleviated mitochondrial calcium overload and improved mitochondrial function by
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modulating inter⁃MAM Ca transfer.
［Key words］ putrescine；mitochondria⁃associated endoplasmic reticulum membrane；oocyte；aging
［J Nanjing Med Univ，2024，44（07）：891⁃900］

随着年龄的增长，女性生育能力逐渐减退，表现 液、TYH 液、HTF 液、KSOM 液、M2 培养液、透明质
［1］
为卵母细胞数量和质量的逐渐下降 。提供细胞能 酸酶（南京爱贝生物有限公司）；4%多聚甲醛固定
量的线粒体功能低下是卵母细胞衰老的一个重要 液（上海碧云天公司）；Triton X⁃100（BioFroxx 公
机制，而近年来的研究提出了内质网⁃线粒体轴的概 司，德国）；PBS 缓冲液（上海塞维尔公司）；DAPI⁃
念。内质网和线粒体密切接触的部位称为线粒体 Fluoromount⁃G 抗荧光淬灭封片剂（SouthernBiotech

相关内质网膜（mitochondria⁃associated endoplasmic 公司，美国）；聚乙烯醇（上海碧云天公司）；LCA⁃
reticulum membrane，MAM），参与脂质合成和运输、 FITC（Invitrogen 公司，美国）；Anti⁃α⁃Tubulin 抗体
2 +
钙（Calium ion，Ca ）稳态、活性氧（reactive oxygen （Abcam 公司，美国）；戊二醛固定液（北京百瑞极公
species，ROS）产生、线粒体自噬和内质网应激等过程， 司）；Fluo⁃4 AM（Invitrogen 公司，美国）；Rhod⁃2 AM、
在细胞的生理和病理活动中起重要作用 。Ca 作为 Mag⁃Fluo⁃4 AM（上海懋康生物公司）；ROS检测试剂
［2］
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［3］
第二信使，是 MAM 界面传递的重要信息物质 。 盒、增强型线粒体膜电位检测试剂盒、增强型 ATP
MAM 间 Ca 传输紊乱已被证实与衰老相关疾病如 检测试剂盒（上海碧云天公司）；Micro RNA Kit
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神经退行性病变 、糖尿病相关病变 、癌症等有 （QIAGEN 公司，德国）；ChamQ SYBR qPCR Master
［5］
［4］
［6］
关，并造成肥胖小鼠卵母细胞质量下降 ，但其在衰 Mix（南京诺维赞公司）。
老卵母细胞中的作用尚未见报道。 1.2 方法
腐胺是能量代谢三羧酸循环中的一种多胺， 1.2.1 动物及分组
由鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成，在抗氧 实验采用 C57/B6J 小鼠，选择 8 周龄小鼠作为
化、抗凋亡和抗炎中发挥重要的作用 。研究发 年轻组，40周龄小鼠作为老龄组。动物实验方案由
［7］
现，高龄小鼠排卵期鸟氨酸脱羧酶活性降低，腐胺 南京医科大学动物伦理委员会批准（实验伦理号：
生成减少。在卵母细胞体外成熟（in vitro maturation， IACUC⁃2208018），所有小鼠均购于南京医科大学实
IVM）培养液中或小鼠排卵期的饮用水中补充腐 验动物基地生产部。小鼠在 22 ℃下保持 12 h/12 h
胺，可以降低卵母细胞非整倍体率和胚胎丢失率， 的暗⁃光循环，自由进食饮水。
［8］
提高高龄小鼠的生育能力 。推测腐胺可以通过 1.2.2 生发泡（geminal vesical，GV）期卵母细胞获取
上调丙酮酸脱氢酶激酶 4 表达和提高线粒体活性 和IVM
来延缓卵母细胞的衰老过程 ［9］ 。然而，腐胺对 以10 U/只小鼠的标准注射PMSG，46~48 h后取
MAM 能否起到调控作用，从而改善卵母细胞质量 GV期卵丘⁃卵母细胞复合体（cumulus⁃oocyte complex，
的研究尚未见报道。本研究使用自然衰老小鼠作 COC）。其中，8周龄小鼠COC记为年轻组（Young），
为研究模型，以卵母细胞中 MAM 为观察指标，在 40 周龄小鼠 COC 记为高龄组（Old），IVM 液中添加
IVM 培养液中添加腐胺，观察其对衰老卵母细胞 0.5 mmol/L 腐胺的高龄组 COC 记为腐胺组（Put）。
的改善作用。 其中IVM液中腐胺添加浓度的标准参考Liu等 ［10］ 研
究。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养14~16 h，然后使
1 材料和方法
用透明质酸酶脱去卵丘颗粒细胞，在显微镜下观察

1.1 材料 卵母细胞第一极体排出情况。收集MⅡ期卵母细胞
孕马血清促性腺激素（PMSG，宁波第二激素 用于后续实验。实验至少重复 3 次，每次每组使用

厂）；腐胺（putrescine，Put，Sigma 公司，美国）；IVM 20~30个COC。