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第44卷第7期 倪 曼，程 丽，郭 爽，等. 腐胺通过线粒体相关内质网膜改善高龄卵母细胞质量［J］.
2024年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（7）：891-900 ·893 ·

1.2.3 体外胚胎培养 以促进完全去酯化。孵育均在37 ℃，5%CO2培养箱
处死 C57/B6J 雄鼠，取附睾并划开输精管，使精 中完成，使用 Nikon Eclipse Ti 共聚焦显微镜拍摄。
子进入 TYH 液中获能 60 min。将 COC 在 HTF 液中 每种指标每组使用15枚卵母细胞进行染色，实验至
清洗 3 次后置于新的液滴中，加入已获能精子共培 少重复3次。
养 4~6 h。在 KSOM 培养液中清洗卵母细胞并在新 1.2.7 ROS和线粒体膜电位测定
鲜的液滴中继续培养，在胚胎发育至二细胞期（受 分别使用 DCFH⁃DA 和 JC⁃1 检测 MⅡ期卵母细
精后24~30 h）和囊胚期（受精后96~100 h）进行拍照 胞 ROS 和线粒体膜电位水平。将卵母细胞分别与
观察。以上培养均在 37 ℃、5% CO2培养箱中完成， DCFH⁃DA 和 JC⁃1 在 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育
实验至少重复3次，每次每组使用20~30个COC。 30 min，然后使用M2培养液清洗3次后置于共聚焦

1.2.4 卵母细胞免疫荧光 皿中。使用Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜检测荧光
MⅡ期卵母细胞脱颗粒后在1% HCl中脱除透明 强度。每种指标每组使用 10~15 枚卵母细胞，实验
带，并清洗3次。随后在4% PFA中室温固定30 min， 至少重复3次。
PBS 清洗 3 次后移入 0.5% Triton×100 中室温破膜 1.2.8 ATP水平测定
20 min。PBS 清洗 3 次后使用封闭液室温封闭 1 h。 使用增强型 ATP 检测试剂盒测量卵母细胞
将卵母细胞移入相应的一抗中 4 ℃过夜，PBS 清洗 ATP 含量。每组使用 20 枚 MⅡ期卵母细胞，在 PBS
3 次后避光室温孵育二抗1 h。PBS清洗3次后使用 中清洗 3 次后移至 10 μL 裂解液中，使每组液体总
DAPI染细胞核，封片。共聚焦显微镜下进行拍照观 量为 20 μL。根据说明书配制标准液。将 ATP 检
察，使用Image J软件进行共定位及半定量分析。实 测试剂和 ATP 检测试剂稀释液按 1∶4 的比例配制
验至少重复3次，每次每组使用15枚卵母细胞。 成ATP检测工作液。每个EP管内加入100 μL ATP
1.2.5 透射电镜拍摄 检测工作液，室温静置 3~5 min，消除本底 ATP。每
每组收集至少 20 枚 MⅡ期卵母细胞，首先在 个检测管内加入 20 μL 标准品或样品混匀，使用
2.5%戊二醛中室温固定2 h，然后使用伊红染色，包 GloMax 20/20 发光检测仪测定相对荧光亮度单位
裹于 1.5%琼脂糖中并离心，使卵母细胞聚集于 EP （relative luminescence unit，RLU）值，并计算每个样
管底。待琼脂糖凝固后再加入戊二醛固定，冰上送 本的ATP浓度。
至南京医科大学分析测试中心进行下一步制样及 1.2.9 RNA提取及qPCR
切片工作。最后使用JEM⁃1400Flash 透射电子显微 使用QIAGEN Micro RNA Kit 提取MⅡ期卵母细
镜观察。 胞总 RNA，随后加入逆转录试剂将 RNA 逆转录为
2+
1.2.6 Ca 水平测定 cDNA。各组基因表达通过实时荧光定量PCR 仪进
分别使用 Fluo⁃4 AM、Rhod⁃2 AM 和 Mag⁃Fluo⁃ 行扩增检测，条件为95 ℃预变性5 min、PCR反应为
4AM 测定 MⅡ期卵母细胞质、线粒体和内质网 Ca 2+ 95 ℃ 15 s、65 ℃ 1 min共40个循环，熔解曲线为65~
水平。按照说明书推荐浓度配制染色工作液。将 95 ℃，每隔 0.5 ℃进行信号检测绘制。各组基因表
卵母细胞在染色工作液中孵育30 min，使用M2培养 达差异采用2 -ΔΔCT 相对定量法进行分析，引物序列见
液清洗3次后再次在新鲜的M2培养液中孵育30 min， 表1。

表1 引物序列表
Table 1 Primer sequences
Gene Forward（5’→3’） Reverse（5’→3’）
GAPDH AGGTCGGTGTGAACGGATTTG TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
IP3R CGTTTTGAGTTTGAAGGCGTTT CATCTTGCGCCAATTCCCG
GRP75 ATGGCTGGAATGGCCTTAGC CATCTTGCGCCAATTCCCG
VDAC1 CCCACATACGCCGATCTTGG GTGGTTTCCGTGTTGGCAGA
IP3R：the inositol 1，4，5⁃trisphosphate receptor；GRP75：G protein⁃coupled receptor 75；VDAC1：voltage dependent anion channel 1.

1.3 统计学方法 料间比较采用独立样本t检验，多组资料间比较采用
所有数据均以均数±标准差（x ± s）表示，两组资 单因素方差分析，所有统计学结果均采用GraphPad