Page 10 - 南京医科大学自然版
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第44卷第8期
               ·1038 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年8月


              light scattering，DLS）实验，测定载体质粒复合体的                体，室温孵育30 min后，使用DMEM或MEN补足体积
              水合粒径。取适量的纳米材料与1 μg质粒，按不同                          至500 μL，对细胞进行换液。在培养箱孵育8 h后，换
              的质量比配制成混合物，室温孵育 30 min 后，用超                       回完全培养基，继续孵育48 h。弃培养基进行细胞荧
              纯水补充至1 mL，用粒径仪测定载体质粒复合体的                          光染色实验，固定细胞后使用DAPI染色，通过倒置荧
              水合粒径。每次测试重复3次，取平均值进行统计。                           光显微镜观察荧光情况。
              1.2.6 纳米载体质粒复合体稳定性实验                              1.2.11 细胞内吞
                  按载体与质粒质量比为4.0配制载体质粒复合                              将 HEK293FT 细胞接种于盖玻片上，待细胞长
              体，孵育 30 min 后，利用激光粒度仪测定载体质粒                       到合适密度时，按质量比为 4.0 制备 SPFT⁃FITC/len⁃
              复合体的水合粒径。随后将其在 4 ℃下保存，并在                          tiCRISPR v2 复合体，室温孵育 30 min 后，用 DMEM
              第0、24、48、72 h取出测定其水合粒径。                           或 MEM 补足体积至 500 μL。分别在孵育 2、4、6 h
                  测定纳米胶束在不同溶液中稳定性时，配制好                          后，弃去含载体质粒复合体的培养基进行细胞免疫
              载体质粒复合体后，用 900 μL 5%葡萄糖（glucose，                  荧光实验，置于共聚焦显微镜下观察。
              Glu）溶液稀释，在第0、24、48 h测定其水合粒径。                      1.2.12 纳米载体的体内分布
              1.2.7 细胞培养                                             在固定的 Cy5.5 质量条件下，用 5%Glu 溶液将
                  HEK293FT 细胞培使用含 10% 胎牛血清 FBS、                 SPFT⁃Cy5.5 及游离 Cy5.5 补足至 200 μL，现配现
              100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖                   用。通过尾静脉注射将SPFT⁃Cy5.5或Cy5.5递送至
              培养基进行培养。Neuro 2a 细胞使用含 10% FBS、                   C57BL/6J 小鼠体内，分别在第0、24、36、44 h对不同
              100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 MEM 最低               的小鼠进行尾静脉注射。随后在第48 h进行小鼠解
              必需培养基进行培养。细胞培养条件为 37 ℃、5%                         剖，收集小鼠大脑并在活体成像仪上进行荧光观察。
              CO2。细胞解冻后慢溶速冻，当细胞长满至 90%~                         1.2.13 纳米载体搭载质粒的体内转染实验
              95%时传代，2 d换1次培养基。                                      按体外转染实验探究出的最适质量比配制纳
              1.2.8 CCK⁃8测定细胞活力                                 米载体质粒复合体，用 5% Glu 溶液补足体积至
                  使用完全培养基将纳米材料稀释至6.25、10.00、                    200 μL，现配现用。通过尾静脉注射将载体质粒复
              12.50、20.00、25.00、50.00 μg/mL，体 积 为 100 μL。       合体递送至 C57BL/6J 小鼠体内，每 3 d 注射 1 次，共
              实验前 1 d，将 Neuro 2a 细胞铺于 96 孔板中，待细胞                注射 3 次，注射结束后第 3 天取小鼠大脑进行冰冻
              长至 80%时更换为含不同浓度纳米材料的完全培养                          切片。5%BSA室温封闭1 h，NeuN一抗在4 ℃孵育过
              基。培养24 h后，吸除96孔板中的培养液，每孔加入                        夜；相应二抗室温孵育1 h；PBS洗涤3次，每次5 min；
              100 μL 含 CCK⁃8 试剂的培养液，37 ℃处理 30 min。              DAPI 室温孵育 10 min；抗荧光淬灭剂进行封片，激
              测定450 nm波长处的吸光度值，计算细胞活力。                          光共聚焦显微镜进行荧光成像。
              1.2.9 溶血实验                                        1.3  统计学方法
                  取适量 C57BL/6J 小鼠新鲜血液，2 000 r/min 离                  使用SPSS 26.0软件进行数据分析。两组间比较
              心10 min，重复2~3次直至上清无色，取少量红细胞                       采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分
              沉淀加入生理盐水或其他缓冲液，制得 2% 红细胞                          析。作图工具为Graphpad Prism 8，数据用均值±标准
              悬液（0.2 mL 红细胞沉淀+10 mL 生理盐水）。将不                    误（x ± sx）表示，P < 0.05为差异有统计学意义。
              同浓度的纳米载体加入红细胞悬液中，制得不同
                                                                2  结 果
              终浓度的纳米载体红细胞混合溶液。双蒸水与生
              理盐水分别作为阳性与阴性对照组。37 ℃孵育3 h                         2.1  SPFT的合成表征
              后，分别以 2 000 r/min 离心 10 min，取 100 μL 上清                通过一系列化学反应成功合成SPF纳米胶束（图
              于 96 孔板中，测 541 nm 波长处的吸光度值，计算                     1A）。对该材料进行了化学成分和化学键的表征。
              溶血率。                                              首先对中间产物 PF 和 SPF 的结构和成分进行了分
              1.2.10 细胞转染                                       析，F NMR（图1B）显示，在-81、-119和-127处都出
                                                                   19
                  测试前1 d种板，待细胞密度达到80%时进行转                       现了—CO—CHF2、—CHF2和—CF3的特征峰，表明氟
              染。按实验要求配制载体与含增强型绿色荧光蛋白                            元素的成功修饰         ［17］ 。FTIR 显示（图 1C），与 PEI25K
             （green fluorescent protein，GFP）质粒（pLL3.7）的复合       及 PF 相比，SPF 在 1 646 cm 和 1 560 cm 出现了
                                                                                                      -1
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