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第44卷第8期      郭小瑭，卢席缘，李聚学. 氟化聚乙烯亚胺衍生物构成的胶束载体的构建、表征及其在跨血⁃脑屏障
                  2024年8月            递送中的作用研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（8）：1035-1043                  ·1037 ·


                国），MEM 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（fetal                    于适量的DMSO中。将SA溶液、NHS溶液和EDC溶
                bovine serum，FBS）、青霉素⁃链霉素（10 000 U/mL）、           液活化反应 4 h 后，滴加 PF 溶液，继续在搅拌器上
                0.25%胰酶、PBS（Gibco 公司，美国），Cell Counting            搅拌反应 24 h。将合成产物放入活化后的 10 kDa
                Kit（CCK）⁃8试剂盒（杭州碧云天公司）、神经元核抗                      透析袋中，在无水乙醇中透析12 h，然后在无水乙醇
                原（neuronal nuclei，NeuN）抗体（Abcam公司，美国），            与超纯水的混合溶液中透析 12 h，最后在超纯水中
                山羊抗兔IgG（H+L）、Alexa Fluor Plus 555（Invitrogen      透析 24 h，每 4 h 更换 1 次超纯水。透析结束后，使
                公司，美国），DAPI、抗荧光衰减封片剂（北京索莱                         用 10 kDa 超滤管在 5 000 r/min 离心 15 min 进行超
                宝公司）。质粒 pHIV⁃Luciferase（#21375）分子量为               滤 ，收 集 上 层 液 体 进 行 冻 干 ，冻 干 条 件 为 真 空
                8 608 bp，质粒 lentiCRISPR v2（#52961）分子 量 为          下-80 ℃，持续10~12 h，得到产物SPF。
                14 873 bp，质粒pLL3.7（#11795）分子量为7 647 bp，均              PEI⁃HFAA⁃SA@PS80（简称 SPFT）的合成：称取
                购自武汉淼灵生物公司。                                       适量的 SPF 和 PS80，分别配制成 1 mg/mL 水溶液。
                     纳米粒径及电位分析仪（马尔文公司，英国），                        取 180 μL SPF 水溶液，滴加 20 μL 的 PS80 水溶液，
                冷冻离心机、傅里叶红外光谱仪、CO2细胞培养箱、                          充分吹打混匀后，室温静置 30 min，得到 1 mg/mL
                Nanodrop 2000（Thermo公司，美国），实验超净台（苏                SPFT水溶液 。
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                州安泰公司），生物安全柜（Airstream 公司，新加                          称取一定量的纳米材料进行傅里叶变换红外
                坡），倒置荧光显微镜（Nikon公司，日本）、激光共聚                       吸收光谱（Fourier transformation infrared absorption
                焦显微镜 LSM 800（Zeiss 公司，德国）、扫描电镜                    spectroscopy，FTIR）、核磁共振（nuclear magnetic res⁃
               （scanning electron microscope，SEM）（JEOL 公司，日       onance，NMR）氟 谱（ F NMR）和 NMR 氢 谱（ H
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                本），琼脂糖凝胶电泳仪（上海天能公司），酶标仪                           NMR）来分析修饰物是否修饰成功。
               （Biotek公司，美国），液体核磁仪（南京市鲁克公司）。                      1.2.2 纳米载体搭载质粒形成复合体
                    本研究所使用的HEK293FT和Neuro 2a细胞均                       根据实验需要的纳米材料与质粒的质量比，将
                来源于美国模式培养物集存库（American Type Cul⁃                  一定量的纳米材料水溶液与质粒的水溶液混合在
                ture Collection，ATCC）。本研究使用的小鼠为近交                 超纯水中，并用超纯水补充至合适的体积，使用涡
                系 C57BL/6J，购自南京医科大学医药实验动物中                        旋仪混合完全，室温静置30 min，形成纳米材料包裹
                心。饲养为随机分笼，每笼小鼠 5 只。饲养条件为                          质粒的复合体。
                标准化 SPF 环境：温度 22 ℃、每日 06：00 — 18：00               1.2.3 载体质粒复合体的琼脂糖凝胶阻滞实验
                给予光照，小鼠的进食和饮水均自由进行。所有动                                琼脂糖凝胶制备：称取0.5 g琼脂糖加入锥形瓶
                物实验均在南京医科大学医药实验动物中心和伦                             中，加入 40 mL 1 × TAE 缓冲液（1.25% 琼脂糖），放
                理委员会批准下进行（NO. 210044）。                            入微波炉中高火加热 2 min，稍微摇匀后继续加热
                1.2  方法                                           至二次沸腾，使溶液完全澄清，待溶液降至室温，
                1.2.1 纳米材料的合成及表征                                  按1∶10 000的比例加入核酸染料，充分混合后缓慢
                    PEI⁃HFAA（简称PF）的合成：称取PEI25k 100 mg             倒入模具中，待琼脂糖凝固后制备成胶。
                和 HFAA 40 mg，分别溶于适量的无水甲醇中。将                           琼脂糖凝胶阻滞实验：固定质粒的质量，按载
                PEI 溶液和HFAA 溶液活化反应4 h后，滴加三乙胺                      体与质粒质量比为 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 配制载
               （triethylamine，TEA）40 μL，继续在搅拌器上搅拌反                体质粒复合体。加入上样缓冲液，80 V 电压反应
                应 48 h。将合成产物放入已活化的 10 kDa 透析袋                     40 min，利用凝胶成像系统进行成像并拍照记录结果。
                中，在无水乙醇中透析12 h，然后在无水乙醇与超纯                         1.2.4 纳米载体对质粒的保护
                水的混合溶液中透析12 h，最后超纯水透析24 h，每                           配制琼脂糖凝胶，按载体与质粒的质量比为4.0
                4 h 更换 1 次超纯水。透析结束后，使用10 kDa 超                    配制载体质粒复合体，孵育30 min后，按照使用说明
                滤管在 5 000 r/min 离心 15 min 进行超滤，收集上                书加入DNase I 和肝素，在 37 ℃孵育 2~3 h，设置两
                层液体进行冻干，冻干条件为真空下-80 ℃，持续                          组对照组，为不添加 DNase I 组以及裸露质粒添加
                10~12 h，得到产物PF。                                   DNaseI组，反应结束后，加入上样缓冲液进行凝胶电泳。
                     PEI⁃HFAA⁃SA（简 称 SPF）的 合 成 ：称 取 PF            1.2.5 水合粒径测定
                100 mg、SA 26 mg、EDC 55 mg以及NHS 40 mg，分别溶              利 用 激 光 粒 度 仪 进 行 动 态 光 散 射（dynamic
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