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第44卷第8期 周婷婷，郁心怡，纪雪雯，等. 大别班达病毒mRNA疫苗的构建及初步评价［J］.
2024年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（8）：1120-1125 ·1123 ·

A B 2.2 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒的体外转录验证
M Gn Gn Gn⁃mRNA
将成功构建的 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒经 BamH
Ⅰ酶切线性化后纯化回收，浓度为166.81 ng/μL（图
7 000 bp— —8 369 bp 2A），以纯化回收的线性质粒为模板体外转录为
4 000 bp—
—8 369 bp
mRNA，琼脂糖凝胶电泳分别检测模板和体外转录
后 mRNA 的纯度（图 2B），经测定，使用 700 ng 模板
经过体外转录获得12.9 μg mRNA。

2.3 Western blot 验证 mRNA 可在真核细胞 293FT
细胞内中表达
为了验证完成体外转录的 mRNA 能够在体外
mRNA：IVT+Cap+polyA tail
A：Linearization of Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）plasmids by BamH Ⅰ. B： 表达，首先制备了 Gn 蛋白和抗 Gn 特异性单克隆抗
Identification of Gn⁃mRNA by agarose gel electrophoresis. The lineariza⁃ 体，SDS⁃PAGE和Western blot结果显示Gn蛋白分子
tion of Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）plasmids were used as template to add Cap
量约为37 kDa（图3A、B）。将体外转录获得的3 μg、
and polyA tailing with T7 polymerase to complete in vitro transcription.
6 μg mRNA 使用 Lipofectamine2000 转染到 293FT 细
M：DL 10 000 DNA marker.
图2 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒体外转录鉴定 胞中，Western blot 验证真核细胞 293FT 中 Gn 的表
Figure 2 Identification of transcription of Gn⁃pGEM⁃ 达，结果显示，体外转录获得的 mRNA 能够在真核
3Zf（+）plasmids in vitro 细胞293FT中表达（图3C）。

A B C
kDa M Gn kDa M P Gn Anti⁃Gn antibody M
50 kDa
250
120
150
100 80 37 kDa
75
60 Blank
50 50 mRNA⁃6 μg mRNA⁃3 μg
—37 kDa 42 —37 kDa
37
32
25
20
15 18
10
A，B：Identification of the expression of Gn protein in CHO cells by SDS⁃PAGE and Western blot. C：Identification of the expression of Gn⁃mRNA
in 293FT cells by using anti⁃Gn monoclonal antibody. M：marker；P：positive control.
图3 Western blot鉴定体外转录的mRNA在293FT细胞中的表达
Figure 3 Identification of the expression of IVT mRNA in 293FT cells by Western blot

2.4 DBV mRNA 疫苗能够诱导小鼠表达高水平的 （1∶10和1∶100）孵育后接种于Vero细胞，感染24 h
特异性中和抗体 qPCR 测定病毒的滴度。结果显示，免疫小鼠的血
将完成 LNP 包封的 DBV mRNA 免疫小鼠，4 周 清能够阻止DBV感染细胞，说明mRNA疫苗免疫能
起采集小鼠血清，持续测定6周、8周和10周小鼠血 够诱导小鼠表达特异性中和抗体（图5）。
清效价，结果显示，免疫 4 周，低、中、高 3 个免疫剂
3 讨 论
量组的抗体效价均能达到 1∶640 000（图 4A），且抗
体效价与免疫剂量呈正相关。随着免疫时间延长， DBV自2010年首次被分离发现以来，已在我国
［1］
3组血清抗体效价水平逐渐降低（图4B~D），到免疫 中东部地区导致几千人感染和几百人死亡 。有研
10 周时，但高剂量免疫组抗体效价仍然可达到 究表明，DBV 具有多种传播途径，其中蜱虫叮咬为主
1∶160 000（图4D）。 要的传播方式，也可以通过直接接触患者血液或体液

2.5 病毒中和实验显示小鼠血清能够阻止病毒感 导致人传人，同时存在性传播的潜在风险 ［12-13］ 。传播
染细胞 DBV的蜱虫中长角血蜱为优势种 ［14］ ，无论野生动物
DBV 以 MOI=0.01 与不同稀释比的小鼠血清 还是家养动物都可能成为其传播媒介。长角血蜱