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第44卷第8期              周婷婷，郁心怡，纪雪雯，等. 大别班达病毒mRNA疫苗的构建及初步评价［J］.
                  2024年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（8）：1120-1125                      ·1121 ·


                    发热伴血小板减少综合征（severe fever with                 50%~70%，5只/笼饲养，自由进食及饮水，小鼠免疫
                thrombocytopenia syndrome，SFTS）是发热伴血小板            前，适应饲养 1 周。本研究通过东部战区疾病预防
                减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia        控制中心伦理委员会审核批准（2023001）。
                syndrome virus，SFTSV）感染引起的一种新发传染                      DBV株（JS2012⁃70）由本实验室保存，在Vero细
                病 。SFTS为我国首先发现，并于2010年确认其病                        胞中扩增并用于本研究，病毒扩增和细胞中和实验
                 ［1］
                原体为一种新型布尼亚病毒，此后韩国、日本、越南                           均在生物安全2级实验室内完成。
                和缅甸等陆续有SFTS病例报道            ［2-4］ 。SFTS主要表现        1.1.2 实验试剂
                为发热、白细胞和/或血小板计数降低、淋巴结肿大、                              大肠杆菌 DH5α、293FT 细胞、pGEM⁃3Zf（+）为
                                                 ［5］
                乏力及胃肠道症状等，多数预后良好 。重症患者                            中科南京生命健康高等研究院保存。胎牛血清、
                出现弥散性血管内凝血、多器官功能衰竭、持续性血                           DMEM细胞培养基（Gibco公司，美国），庆大霉素、卡
                小板减少及高炎症因子水平等症状，甚至死亡，病死                           那霉素（Biofroxx 公司，德国），蛋白酶抑制剂（Roche
                           ［6- 7］
                率 12%~30%      。世界卫生组织已于 2017 年将                  公司，瑞士）。质粒中提试剂盒（Sigma 公司，美
                SFTS 列为需要优先研究和干预的新发传染病之                           国），胶回收提取试剂盒（Promega 公司，美国），
                  ［8］
                一 。2019 年 SFTSV 被国际病毒分类委员会更名                      Lipofectamine 2000 转 染 试 剂（Invitrogen 公 司 ，美
                为大别班达病毒（Dabie bandavirus/Bandavirus da⁃           国）。抗Gn单克隆抗体为本室制备，HRP 标记羊抗
                vieense virus，DBV）。                               鼠单克隆抗体（Abcam 公司，美国），RNA 提取试剂
                    到目前为止，DBV 尚无特异性治疗方案和有                         盒（上海飞捷公司），化学发光显色液 ECL（Thermo
                效的疫苗。疫苗在多种传染病防控过程中起着至                             公司，美国），DNA Marker、质粒小提试剂盒、限制性
                关重要的作用。与传统疫苗相比，mRNA 疫苗具有                          内切酶（TaKaRa公司，日本）。引物合成和基因测序
                高效、安全、低成本等优点，其主要通过体外转录合                           均由南京金斯瑞生物技术有限公司完成。
                成，并使用递送系统将mRNA运送进机体，依靠细胞                          1.2  方法
                自身的翻译系统实现蛋白质翻译、翻译后修饰和全                            1.2.1 DBV Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒设计和构建
                部功能 。随着新型冠状病毒疫情的暴发，多种新                                根据本室保存的 DBV 株（JS2012⁃70），GenBank
                      ［9］
                冠病毒 mRNA 疫苗获得紧急授权并投入使用                  ［10-11］ ，  登录号：KY362350.1。分析 M 片段编码的糖蛋白
                在全球掀起了新一轮mRNA疫苗研究热潮。mRNA                          Gn 的序列信息，并经过序列优化后全基因合成克
                疫苗已成为预防和治疗多种疾病最有希望的方案                             隆至 pGEM⁃3Zf（+）载体，基因测序验证质粒构建
                之一。                                               正确。
                    mRNA疫苗在传染病的防治中得到了较为广泛                         1.2.2 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）体外转录和体外表达验证
                的应用   ［11］ 。迄今为止，许多mRNA 疫苗诱导抗病毒                       将构建正确的质粒转化至大肠杆菌DH5α进行
                免疫的临床前和临床试验已经在多种病毒感染疾                             质粒扩增，使用中提质粒试剂盒从200 mL菌液中提
                病中进行，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2、寨                           取纯化质粒。经BamH Ⅰ限制性内切酶进行质粒线
                卡病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒等。本研究                            性化，胶回收试剂盒进行纯化回收。以回收的线性
                设计并构建了DBV mRNA疫苗，评估了该疫苗体外                         化质粒为模板，在体外由 T7 RNA 聚合酶催化合成
                转录和诱导小鼠产生特异性中和抗体的能力，为                             mRNA，同时使用牛痘病毒加帽酶（vaccinia capping
                DBV的防控及疫苗研发奠定基础。                                  enzyme）和mRNA Cap 2’⁃O⁃甲基转移酶（2’⁃O⁃Meth⁃
                                                                  yltransferas）分别添加 Cap0 和 Cap1 完成 mRNA 修
                1  材料和方法
                                                                  饰，使用 E.coli Poly（A）Polymerase 在 mRNA 的 3′端
                1.1  材料                                           添加polyA尾，使用LiCl沉淀法收集产物，琼脂糖凝
                1.1.1 实验动物和病毒株                                    胶电泳验证纯度。利用 Lipofectamine 2000 转染试
                    无特定病原体级，健康雌性6~8周龄BALB/c小                      剂将制备的 Gn⁃mRNA 转染至 293FT 细胞中，转染
                鼠共15只，体重20~25 g，购自斯贝福（苏州）生物技                      24 h后收取蛋白，一抗使用课题组制备纯化的抗Gn
                术有限公司，许可证号：SCXK（苏）2022⁃0006，合格                    特异性单克隆抗体，浓度为1∶1 000，使用HRP标记
                证编号：202377931。饲养于 12 h 光照/12 h 无光照                的羊抗鼠作为二抗，浓度为1∶5 000，Western blot 检
                环境，实验室环境温度控制在（25±1）℃，相对湿度                         测Gn的表达情况。
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