Page 94 - 南京医科大学自然版

第44卷第8期
·1122 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年8月

1.2.3 Gn⁃mRNA疫苗免疫BALB/c小鼠 0.01，将 500 μL 病毒液与 500 μL 血清稀释液混合，
将鉴定正确的 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒委托上海 37 ℃孵育 30 min。同时设置无血清空白对照。移
近岸科技有限公司进行体外转录成 mRNA 并进行 除 6 孔板中的培养基，加入 1 mL 病毒与血清混合
脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）包封。按下 液，每个稀释度设置 3 个平行孔。37 ℃孵育 2 h 后，
述免疫方案免疫小鼠，6~8 周雌性 BALB/c 小鼠，分 移除混合液，补加 2 mL 细胞维持液。24 h 后，按照
低、中和高3个免疫剂量组（每组n=5），注射剂量分 SFTS 布尼亚病毒核酸检测试剂盒（广州达安基因，
别为2 μg/只、5 μg/只和20 μg/只，每2周肌内注射免 DA0340）说明书测定病毒滴度。
疫 1 次，4 周后采集小鼠血清进行 ELISA 分析评估 1.3 统计学方法
mRNA疫苗诱导小鼠产生的中和抗体效价。 使用GraphPad prism 6.0统计软件进行统计学分
1.2.4 ELISA检测小鼠血清抗体表达 析。计量资料用均数±标准差（x ± s）表示，两组间比

真核表达的 Gn 糖蛋白以 100 ng/孔包被 ELISA 较采用t检验。多组间比较采用方差分析，两两比较
板，小鼠尾静脉采血，收集血清，以 1∶100 作为起始 采用LSD法，血清中和病毒的实验使用重复测定的方
浓度，梯度稀释，每个稀释滴度设置 3 个复孔，以 差分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
450 nm 处的吸光度值为空白对照的 2 倍，判读小鼠
2 结 果
血清抗体效价水平。
1.2.5 病毒中和实验 2.1 成功构建DBV Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒
Vero 细胞接种于 6 孔板内，当细胞汇合度达到 通过对 DBV Gn 序列分析，添加 CD5 信号肽序
90%时，接种病毒。用 DMEM 细胞培养基分别稀释 列，优化基因序列并克隆至pGEM⁃3Zf（+）载体中，载
病毒和小鼠血清（稀释比为1∶10、1∶100），选择高剂 体序列信息见图 1A，Gn 序列克隆至表达载体中的
量免疫组中抗体效价高、持续时间长的 3 只小鼠血 示意图如图1B所示，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒
清进行细胞病毒中和实验。病毒接种量为 MOI= 构建正确，大小约为5 172 bp（图1C）。

A Aatll Ndel B
2 260 2 509 5′UTR Gn⁃CD5 3′UTR
T7
1 start
Xmnl 5
1 937 EcoRⅠ 15 （32）EagⅠ⁃NotⅠ PasⅠ（58）
SacⅠ
Scal f1 ori KpnⅠ 21 （22）EcoRⅠ AleⅠ（100）
NcoⅠ（136）
1 818 AvaⅠ 23 BstXⅠ（137）
SmaⅠ
BglⅡ（286）
Amp’ pGEM⁃3Zf（+） BamHⅠ 26 （4 779）BtgZⅠ BgbvCⅠ⁃Bpu10Ⅰ（327）
32
Vectors facZ XbaⅠ 38 BlpⅠ（432）
（3 197 bp） SaⅡ 39 （4 650）PsiⅠ
AccⅠ
HincⅡ 40 5 000
PstⅠ 48
SphⅠ 54 （4 501）NdeⅠ
HindⅢ 56 f1 M13F
ori 69 5′UTR
SP6 CD5 signal peptide
（4 252）AatⅡ Initiator
AmpR promoter OFR⁃Gn 1 000 SfiⅠ（1 044）
From Promega （4 250）ZraⅠ BbsⅠ（966）
C Superooiled DNA
4 000 pGEM⁃3Zf（+）_Gn⁃CD5 SP
bp M Gn ladder marker BclⅠ*（1 234）
KasⅠ（1 374）
NarⅠ（1 375）
bp （3 810）ScaⅠ AmpR 5172 bp PluTⅠ（1 378）
SfoⅠ（1 376）
Terminator EcoNⅠ（1 457）
—11 849 BamHⅠ 3′UTR
—10 085 SP6
—8 023 Lac promoter 2 000 BamHⅠ（2 018）
8 023— —6 133 （3 330）AhdⅠ Ori SalⅠ（2 030）
XbaⅠ（2 024）
6 133— —5 026 3 000 HincⅡ（2 032）
AccⅠ（2 031）
5 023— —5 172 —3 997 HindⅢ（2 048）
SbfⅠ（2 040）
3 997— —3 049
3 049— （2 853）AlwNⅠ
AflⅢ⁃PciⅠ（2 437）
—2 087
2 087—
A：pGEM⁃3Zf（+）vector circle map and sequence reference points. B：Construction of Gn protein of DBV into pGEM⁃3Zf（+）vector. C：Identifica⁃
tion of Gn⁃ pGEM⁃3Zf（+）plasmids by agarose gel electrophoresis，the size of Gn⁃ pGEM⁃3Zf（+）was about 5 172 bp，M：DL 10 000 DNA marker.
图1 Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）质粒构建和鉴定
Figure 1 Construction and identification of Gn⁃pGEM⁃3Zf（+）plasmid