Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第12期
               ·1730 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年12月


              PS+1%生物素/泛酸+1 μg/mL insulin，分化培养基每                定量实验各组数据以均数±标准差（x ± s）表示。使
              2 d换1次液，在诱导之后6~8 d细胞分化成熟，出现                       用独立样本 t 检验分析两组数据之间的差异性，使
              明显的脂滴后进行后续的其他实验。                                  用 one way ANOVA 分析多组数据之间的差异性。
                  BAC 褐色脂肪前体细胞使用生长培养基进行                         P < 0.05为差异有统计学意义。
              普通传代培养：DMEM+10%FBS+1%PS，细胞生长至
                                                                2  结 果
              70%左右进行传代。将要分化的BAC细胞铺板后换
              为分化培养基：DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL                 2.1  miR⁃190在衰老褐色脂肪组织与白色脂肪组织
              insulin+1 nmol/L三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，        中的表达
              T3），待其生长至90%及以上用诱导培养基进行诱导：                             Sirtuins蛋白家族又被称为长寿蛋白家族，其中

              DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL insulin+1 nmol/L       SIRT3 主要定位于线粒体，并被报道具有拮抗人干
              T3+500 μmol/L IBMX+5 μmol/L Dex+0.125 mmol/L      细胞衰老的作用。相关研究表明，SIRT3 与衰老呈
              Indo。将 BAC 细胞在诱导培养基中保持48 h以上，                     现负相关性      ［12］ 。随着小鼠月龄的增加，小鼠iBAT与
              然后换为分化培养基，分化培养基每2 d换1次液，在                         iWAT中SIRT3的表达水平逐渐下降，证明了衰老进
              诱导之后 6~8 d细胞分化成熟，然后每天换新鲜分化                        程的发展（图 1A、B）。为了进一步确定 miR⁃190 与
              培养基，出现明显脂滴后进行后续其他实验。                              衰老之间的相关性，我们分别比较了不同年龄段小
              1.2.5 细胞衰老模型构建                                    鼠 iBAT 与 iWAT 中 miR⁃190 的表达水平。RT⁃PCR
                  利用H2O2与棕榈酸（palmitic acid，PA）在体外构              的结果显示，iBAT 与 iWAT 中，随着衰老进程的发
              建细胞衰老模型。在 3T3L1 白色脂肪前体细胞和                         展，miR⁃190 的表达水平呈现逐渐上升的趋势（图
              BAC褐色脂肪前体细胞出现明显脂滴后，进行诱导                           1C、D），提示 miR⁃190 的表达水平与衰老呈现正相
              衰老处理：分别配制用培养基稀释的 100 μmol/L 的                     关性。众所周知，褐色脂肪组织是一种“燃烧脂
              H2O2溶液和200 μmol/L的PA溶液，随后将配制好的                    肪”，可以产生热量。有意思的是，miR⁃190 在褐色
              溶液加入模型组细胞 24 h 孵育。吸去含有 H2O2和                      脂肪组织中的表达水平最高，而在内脏白色脂肪组
              PA的培养基，收取细胞样品。                                    织（eWAT）中表达最低，说明miR⁃190的表达可能与
              1.2.6 荧光素酶报告基因实验                                  脂肪组织的产热有关（图1E）。
                  将处于生长对数期的 HEK 293T 细胞进行铺                      2.2  miR⁃190在体外衰老脂肪细胞中的表达
              板，细胞增殖至 80%左右进行转染，报告基因质粒                               此外，利用 H2O2与 PA 在体外构建细胞衰老模
              转染24~48 h后取出细胞板终止培养。根据试剂盒                         型 ［13］ ，以验证上述体内实验的结果。图 2A~D 证明
              操作说明进行后续实验。                                       了体外细胞衰老模型的构建成功。RT⁃PCR 的结果
              1.2.7 定量PCR                                       显示，无论是在褐色脂肪细胞（BAC）还是白色脂肪
                  采用 TRIzol 试剂（Invitrogen 公司，美国）按操作             细胞（3T3L1）中，H2O2 和 PA 均可以使脂肪细胞中
              说明书提取脂肪组织和细胞中的总 RNA。根据试                           miR⁃190 水平升高，这与体内结果也是吻合的（图
              剂盒操作说明进行后续实验。                                     2E~H）。
              1.2.8 蛋白质免疫印迹        ［11］                         2.3 miR⁃190抑制脂肪细胞产热基因的表达
                  小鼠组织及细胞在匀浆后 10 000 r/min 离心                        由于脂肪组织衰老会引起脂肪组织产热基因
              20 min 得到上清。使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度                      表达的降低，我们首先检测了衰老细胞模型和衰老
              作为内参，在保证蛋白量一致的情况下确定组织上                            小鼠中产热相关基因 PR 结构域蛋白 16（PR domain

              清液体积。在组织上清液中加入5×上样缓冲液（5×                          containing 16，PRDM16）的 mRNA 表达。结果显示，
              loading buffer）后 100 ℃加热 10 min，即可获得组织            PRDM16的mRNA表达水平在两种衰老细胞模型中
              样品。用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，待条带                           均显著下降（图 3A、B）。在衰老小鼠的 iBAT 与
              跑开后转膜，用 5%TBST 牛奶封闭 1 h，分别加入内                     iWAT中也得到了相似的结果（图3C、D）。接着向褐
              参和相应的一抗进行孵育，TBST充分洗涤后再加入                          色 脂 肪 细 胞 与 白 色 脂 肪 细 胞 中 转 染 miR ⁃ 190
              二抗进行孵育，TBST充分洗涤后上机检测。                             agomir，并进行RT⁃PCR。结果显示，miR⁃190的过表

              1.3  统计学方法                                        达会显著降低褐色脂肪细胞中产热相关基因解耦
                  数据用 GraphPad5.0 进行分析，除特别标注外，                  联蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1）、PRDM16、细
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