Page 92 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第10期
·1434 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年10月

65 ℃ 30 s，5 个循环；再 94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1.3 统计学方法
30 s，20 个循环；最后 72 ℃ 充分延伸 5 min，10 ℃保 采用 SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理。采
温。初次PCR结束后进行第二轮扩增，引入Illumina 用mothur软件计算生物多样性指数，并利用R 3.6.0
桥式 PCR 兼容引物，扩增体系采用 30 μL：2×Hieff ® 软件制作 Chao1 指数和 Shannon 指数的差异检验箱
Robust PCR Master Mix 15 μL，引物各 1 μL，PCR 产 线图以及PcoA主坐标分析图。采用STAMP 2.1.3软
物 10~20 ng，灭菌双蒸水 9~12 μL，反应条件：95 ℃ 件对不同喂养组间的差异类群进行分析。对于符
预变性 3 min；然后94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s， 合正态分布的连续型变量，采用均数±标准差（x ± s）
5 个循环；再 72 ℃充分延伸 5 min，10 ℃保温。所得 进行描述，对于不符合正态分布的连续型变量，采
PCR产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳检测质量。 用中位数（四分位数）［M（P25，P75 ）］进行描述；对于
1.2.3 文库构建及上机测序 分类变量，采用频数和百分数进行描述。对于满足

TM
使用 Yeasen 公司的 Hieff ＮGS DNA Selection 参数检验的连续型变量，采用两独立样本 t 检验进
Beads 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库 行组间比较或采用配对 t 检验进行组内前后比较；
使用 Qubit3.0 荧光定量仪进行文库浓度测定，合格 对于不满足参数检验的连续型变量，采用 Wilcoxon
后使用Illumina Miseq /Hiseq 平台进行测序。 秩和检验进行组间比较；对于数目方差不等的两组
TM
TM
1.2.4 生物信息学分析 间比较采用Welch’s⁃t检验；对于分类资料采用χ 检
2
测序所得的原始序列经过优化处理和质控 验或Fisher确切概率法检验。所有统计推断均采用
过滤后，获得优化序列。利用 Usearch 软件将优 双侧检验，检验水准α=0.05。
化序列基于 97%相似性进行聚类为操作分类单位
（operational taxonomic unit，OTU），得到 OTU 代表序 2 结 果
列后进行比对生成 OTU 表格。利用 RDP classifier 2.1 一般情况
与RDP数据库（http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources. 20 例新生儿（均为阴道顺产娩出；8 例母乳喂
jsp）比对，对物种进行注释，从而获得每个 OTU 对 养，12例混合喂养）中，性别（P=1.000）、胎龄（P=0.607）、
应的物种分类信息。基于样品测序产生的 OTU 结 出生体重（P=0.281）、母孕期增重（P=0.114）及孕母
果，利用 mothur 做 rarefaction 分析；利用 R 软件绘制 年龄（P=0.625）均没有显著差异（表 1）。新生儿生
稀释曲线；利用 mothur 计算单个样本的 Alpha 多样 后 1 min、5 min 和 10 min 的 Apgar评分均为10分，参
性（OTU 数目、Chao1 指数、Shannon 指数）。在门和 与本研究的母亲和新生儿在样本采集前或采集时
属两个分类水平上统计样本的物种丰度，并行聚类 均未接受任何抗生素治疗及益生菌暴露。母孕期
分析。 均无妊娠期高血压疾病、糖尿病、感染等并发症。

表1 两组新生儿临床基本情况的比较
Table 1 Comparison of clinical basic characteristics between two groups of newborns
组别 性别（女/男，n/n） 胎龄（d，x ± s） 母孕期增重（kg，x ± s） 孕母年龄（岁，x ± s）
纯母乳喂养组（n=8） 2/6 276.63 ± 8.09 13.00 ± 3.74 29.38 ± 4.24
混合喂养组（n=12） 2/10 278.25 ± 3.62 15.83 ± 3.74 30.00 ± 4.94
P值 1.000 * 0.607 0.114 0.625
Fisher确切概率法。
*
2.2 高通量测序情况 目，292个科，736个属。
所有样本均含有可检测到的细菌 16S DNA， 2.3 细菌丰富度和多样性的特异性指数分类
40 例样本经测序共获得原始序列 2 758 724 条，经 2.3.1 样本类型的丰富度和多样性（α多样性）
过滤处理后，最终用于后续分析的有效序列为 用 Chao1 指 数 计 算 每 个 样 品 的 丰 富 度 ，用
1 847 830条，平均碱基长度（422.415±5.609）bp。序 Shannon 指数评价多样性，同时考虑相对丰富度和
列深度足以获得所有样本的高度序列覆盖（平均值 均匀度。图1显示了统计学分析指数估计口咽群落
为 0.998；中位数为 0.999；范围为 0.988~0.999）。在 的物种丰富度和多样性。由图可见，不同时点混
OTU 水平上，总共检测到 36 个门，84 个纲，144 个 合喂养组的丰富度和均匀度均高于纯乳母喂养