Page 8 - 南京医科大学自然版
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第44卷第12期
               ·1622 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年12月


                  化疗作为治疗恶性肿瘤的常用手段，有导致卵                          美国）；DNMT3A（Thermo公司，美国）；Micro RNA Kit
                                     ［1］
              巢功能不全和不孕的风险 。环磷酰胺（cyclophos⁃                     （QIAGEN 公司，德国）、High⁃Capacity cDNA Reverse
              phamide，CTX）是临床常用的烷化剂型化疗药物，广                      Transcription Kit（Thermo公司，美国）；QIAGEN Micro
              泛应用于包括儿童血液系统肿瘤在内的多种恶性                             RNA kit（QIAGEN 公司，美国）ChamQ SYBR qPCR
              肿瘤和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗                             Master Mix（南京诺维赞公司）。
              中。在体内CTX通过肝脏细胞色素p450（cytochrome                   1.2  方法
              P450，CYP450）转化为 4⁃羟基环磷酰胺（4⁃hydroxy⁃               1.2.1  小鼠饲养
              cyclophosphamide，4⁃HC） 。4⁃HC 作为 CTX 在体内                实验采用 3~6 周青春期前期 C57/B6J 小鼠。所
                                    ［2］
                             ［3］
              的主要活性物质 ，可用于体外 CTX 细胞损伤模型                         有小鼠均购于南京医科大学实验动物基地生产
                    ［4］
              的制备 ，该种造模方法被证明可以在体外造成培                            部。小鼠在 22 ℃下保持 12 h/12 h 的暗⁃光循环，自
                           ［5］
              养卵泡的缺失 ，颗粒细胞的凋亡 等 CTX 体内作                         由进食饮水。动物实验方案由南京医科大学动物
                                             ［6］
              用相似表型。                                            伦理委员会批准（实验伦理号：IACUC⁃2202033），遵
                  有研究报道，CTX可导致40%女性发生早发性卵                       循3R原则。
              巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI） ，      1.2.2  卵母细胞获取和体外成熟
                                                         ［7］
              严重影响女性生育力。基于此，越来越多的青春期                                 下午4：00-5：00，小鼠腹腔内注射PMSG10 U/只。
              前女性在化疗前采用卵巢组织冷冻进行生育力保                             46~48 h后取卵巢生发泡期（germinal vesicle，GV）卵
              存 。然而如何提高生育力保存的效率，特别是                             丘 卵 母 细 胞 复 合 体（cumulus oocyte complex，
                ［8］
              对经历过化疗的患者，成为临床近年来讨论的热                             COC），随机分组，于 IVM 培养液中加入 4⁃HC 储
              点和焦点问题。随着技术的不断进步，卵巢组织                             存液（10 mg 4⁃HC加入341 μL溶剂DMSO中，配制成
              冷冻的同时进行未成熟卵巢组织卵母细胞体外成                             100 mmol/L的储存液，分装并充入惰性气体，-80 ℃保
              熟（ovarian tissue oocyte⁃in vitro maturation，OTO⁃IVM）  存），根据培养微滴内 4⁃HC 浓度分为空白对照组
              技术，已在许多紧急抗癌治疗患者中得到了越来越                           （Mock）、溶剂对照组（Ctrl）、0.3 μmol/L 4⁃HC 组、
              广泛的临床应用 。研究数据显示，IVM联合IVF获                         1.0 μmol/L 4⁃HC组、3.0 μmol/L 4⁃HC 组、10.0 μmol/L
                            ［9］
              得的活产率与常规控制性促排卵进行IVF助孕的活                           4⁃HC组、30.0 μmol/L 4⁃HC组和100.0μmol/L4⁃HC组。
              产率相当    ［10］ ，因此，OTO⁃IVM 有望成为化疗人群生                用 100.0 μL 枪头迅速轻柔吹吸 5 下，混合均匀后
              育力保存的有效候选方案。本研究通过在体外培                             放置 37 ℃、5% CO2培养箱培养 14~16 h（空白对照
              养过程中直接添加 4⁃HC，模拟 CTX 化疗，探究其对                      组为 IVM 培养液，溶剂对照组为 DMSO 1∶1 000 稀
              卵母细胞发育潜能的影响，并探索CTX作用的可能                           释液），然后使用透明质酸酶脱去颗粒细胞，在显
              潜在靶点，为女性生育力保护和提高 IVM⁃IVF 的活                       微镜下观察卵母细胞第一极体排出情况，以第一
              产率提供坚实的理论基础。                                      极体排出作为卵母细胞核成熟的表征。收集减数
                                                                第二次分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ）卵母细胞用于
              1 材料和方法
                                                                后续实验。每组使用 20~30 枚卵母细胞，实验至
              1.1  材料                                           少重复 3 次。
                  孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum go⁃             1.2.3  观察测量卵丘颗粒细胞扩张
              nadotropin，PMSG，宁波第二激素厂）；4⁃HC（Cayman                   上述1.2.2方法培养14~16 h后，4倍显微镜下拍
              公司，德国）；IVM 液、透明质酸酶、TYH 液、HTF 液、                   摄观察卵丘颗粒细胞扩张，并使用Image J测量成熟

              KSOM 液、M2培养液（南京爱贝生物有限公司）；4%                       COC长轴直径与短轴直径，取平均值作为卵丘颗粒
              多聚甲醛固定液、封闭液、聚乙烯醇、活性氧（reactive                     细胞扩散直径。
              oxygen species，ROS）检测试剂盒、JC⁃1 增强型线粒               1.2.4  体外胚胎培养

              体膜电位检测试剂盒（上海碧云天公司）；Triton X⁃                           处死 C57/B6J 雄鼠，取附睾尾部并划开输精
              100（BioFroxx 公司，德国）；PBS 缓冲液（武汉塞维尔                 管，使精子在 TYH 液中获能 60 min。将卵母体
              公 司）；Dapi ⁃ Fluoromount ⁃ G 抗 荧 光 淬 灭 封 片 剂       外成熟的 COC 在 HTF 液中清洗 3 次后置于新的
             （SouthernBiotech 公司，美国）；LCA⁃FITC、还原型谷              液滴中，加入已获能精子共培养受精 4~6 h。在
              胱甘肽（glutathione，GSH）荧光探针（Invitrogen公司，            KSOM 培养液中清洗卵母细胞并在新鲜的液滴
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