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第44卷第12期               程   丽，倪 曼，王 洁，等. 环磷酰胺对卵母细胞发育潜能影响的研究［J］.
                 2024年12月                  南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1621-1628，1648                   ·1623 ·


                中继续培养。受精后 12 h 能观察到双原核的细                          1.2.6 ROS、还原型（GSH）和线粒体膜电位测定
                胞作为受精卵。在胚胎发育至二细胞期（受精                                  使用DHE、还原型GSH探针和JC⁃1检测MⅡ期
                后 24~30 h）和囊胚期（受精后 96~100 h）进行拍                   卵母细胞 ROS、GSH 和线粒体膜电位水平。将卵母
                照观察。以上培养均在 37 ℃、5%CO2 培养箱中                        细胞分别与 DHE 和 JC⁃1 工作液在 37 ℃、5%CO2 培
                完成，每组使用 20~30 枚卵母细胞，实验至少重                         养箱中孵育 30 min，然后使用 M2 培养液清洗 3 次
                复 3 次。                                            后置于共聚焦皿中。使用Nikon Eclipse Ti共聚焦显
                1.2.5  卵母细胞免疫荧光                                   微镜检测荧光强度。每种指标每组使用 10~15 枚
                    卵母细胞脱颗粒后清洗 3 次，随后在 4% 多聚                      卵母细胞，实验至少重复3次。
                甲醛中室温固定 30 min，在添加了 0.5%聚乙烯醇                      1.2.8  RNA提取及RT⁃qPCR
               （polyvinyl alcohol，PVA）的 PBS 溶液中清洗 3 次后                使用 QIAGEN Micro RNA Kit 提取卵母细胞总

                移入 0.5% Triton X⁃100 中室温破膜 20 min。0.5%            RNA，提取的 RNA 立刻冰上加入 High⁃capacity tran⁃
                PVA清洗3次后使用封闭液室温封闭1 h。将卵母细                         scription Kit逆转录试剂25 ℃ 10 min、37 ℃ 120 min、
                胞移入相应的一抗中 4 ℃过夜，0.5% PVA 清洗 3 次                   85 ℃ 5 min 将RNA 逆转录为cDNA。各组基因表达
                后避光室温孵育二抗 1 h。0.5% PVA 清洗 3 次后                    通过实时荧光定量 PCR 仪进行扩增检测，条件为
                使用 DAPI 染细胞核，封片。共聚焦显微镜下进行                         95 ℃预变性 5 min、PCR 反应为 95 ℃ 15 s、65 ℃
                拍照观察，使用 Image J 软件进行共定位及半定量                       1 min 共 40 个循环，熔解曲线为 65~95 ℃每隔 0.5 ℃
                分析。每组使用 15~30 枚卵母细胞，实验至少重复                        进行信号检测绘制。各组基因表达差异采用 2                      -ΔΔCT
                3次。                                               相对定量法进行分析。本实验引物序列见表1。

                                                         表1 引物序列表
                                                     Table 1  Primer sequences
                      Gene                      Forward（5′→3′）                          Reverse（5′→3′）
                     Gapdh               AGGTCGGTGTGAACGGATTTG                   TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
                     Dnmt3a              GATGAGCCTGAGTATGAGGATGG                 GATGAGCCTGAGTATGAGGATGG

                1.3  统计学方法                                        2.2  1.0 μmol/L 4⁃HC 作用下卵母细胞体外成熟及
                    所有统计学结果均采用 GraphPad Prism 8进行                 囊胚发育情况
                分析，数据均以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比                           与溶剂对照组相比，1.0 μmol/L 4⁃HC作用下GV
                较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方                          期 COC 体外成熟后扩散程度降低（152.200±26.780
                差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。                            vs. 132.600±23.130，P < 0.05，图2A、B），第一极体排
                                                                  出率下降（0.804±0.053 vs. 0.653 ± 0.074，P < 0.05，
                2 结    果
                                                                  图 2A、C），囊胚形成率下降（0.809±0.087 vs. 0.566±
                2.1  不同浓度4⁃HC对卵母细胞发育潜能的影响                         0.175，P < 0.05）。这些结果提示1.0 μmol/L 4⁃HC 作
                    为探究4⁃HC对卵母细胞的直接作用及其机制，                        用下 GV 期 COC 体外成熟后成熟率下降，进而影响
                                      ［4］
                基于先前 4⁃HC 相关研究 ，本研究设定了 4⁃HC 浓                     卵母细胞胚胎发育，造成囊胚形成率降低。
                度梯度：0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100.0 μmol/L，将GV        2.3  4⁃HC作用下卵母细胞发生氧化应激
                期COC取出后，直接在培养基中添加上述不同浓度                               GSH 与 DHE 染色结果显示 1.0 μmol/L 4⁃HC 使
                的4⁃HC，结果发现，随着 4⁃HC 浓度的增加，卵母细                      体外培养至 MⅡ期的 COC 中卵母细胞内 GSH 含量
                胞的二细胞率及囊胚率呈下降趋势（图 1A、B），                          降低（图 3A、B），超氧化物阴离子含量升高（图 3A、
                这提示 4⁃HC 会损害卵母细胞的发育潜能。基于                          C），提示1.0 μmol/L 4⁃HC影响下卵母细胞发生氧化
                1.0 μmol/L 浓度组的囊胚率与溶剂对照组相比已                       应激。
                显著降低（0.809±0.050 vs. 0.565±0.101，P < 0.05，        2.4  4⁃HC导致卵母细胞线粒体功能下降
                图 1C），且该浓度与 CTX 化疗患者血清中的药物浓                           线粒体在卵母细胞功能中起着至关重要的作
                度相当   ［11］ ，故后续将此浓度用于实验组进行进一                      用，线粒体功能受损将严重影响卵母细胞发育，造
                步探究。                                              成卵母细胞质量受损         ［12］ 。本课题组对培养至MⅡ期
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