Page 108 - 南京医科大学自然版

第44卷第8期
·1136 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年8月

one second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity， 分溶解。
FVC）及第1秒用力呼气量占用力肺活量比例（FEV1/ cDNA 合成：向反应管中加入 2.5 μg total RNA、
FVC）肺功能指标。 1 μL dNTP（10 mmol/L）、1 μL Oligo dT Primer
1.2.2 外周血单核细胞 NLRP3 炎性小体转录水平 （50 μmol/L），无核酸酶水补足总体积至 10 μL，于
测定 65 ℃作用 5 min，转移至冰上冷却；向反应管中
外周血单核细胞分离：取新鲜抗凝血，与等体 继 续 加 入 4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μL
积生理盐水混匀；加入 2 倍体积淋巴细胞分离 RNase Inhibitor（40 U/μL）、1 μL PrimeScript Ⅱ
液，经400 g离心20 min；收集第2层细胞，转入 4 倍 RTase（200 U/μL）、4.5 μL 无核酸酶水，混匀后依次
体积生理盐水中，充分洗涤后经 400 g 离心 20 min； 置于42 ℃ 30 min、95 ℃ 5 min，转移至冰上冷却。
重复2次后收集细胞沉淀。 荧光定量：向反应管中加入 12.5 μL FastStart

RNA 抽提：向细胞沉淀中加入 1 mL RNAiso Universal SYBR Green Master（ROX）、0.75 μL 上游
Plus，室温裂解5 min，经12 000 g 4 ℃离心5 min；收 引物（10 μmol/L）、0.75 μL 下游引物（10 μmol/L）、
集上清液加入 1/5 体积的氯仿，涡旋混匀，室温作 1 μL cDNA模板、10 μL无核酸酶水，充分混匀；按照
用 5 min，经 12 000 g 4 ℃离心 15 min；收集上清加 反应条件95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40个循
入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温作用 10 min， 环进行PCR扩增。引物序列参照表1 ［11］ 。每样本做
经 12 000 g 4 ℃离心 10 min；弃掉上清，加入等体积 3 个技术重复，复孔 CT 差值不得>0.5。采用 2 -ΔΔCt 相
75% 无 水 乙 醇 ，颠 倒 混 匀 ，经 7 500 g 4 ℃ 离 心 对定量法测定 Nlrp3、Caspase⁃1、Il⁃1β基因相对管家
5 min；弃掉上清，风干后加入 10 μL 无核酸酶水充 基因Gapdh的转录水平。

表1 荧光定量PCR引物
Table 1 Primers of qPCR

Gene Primer sequence（5’➝3’） Tm（℃） Size（bp）
Gapdh Forward：AAGGCTGTGGGCAAGG 56 16

Reverse：TGGAGGAGTGGGTGTCG 57 17
Nlrp3 Forward：AAGGGCCATGGACTATTTCC 55 20
Reverse：GACTCCACCCGATGACAGTT 57 20
Caspase⁃1 Forward：TCCAATAATGCAAGTCAAGCC 55 21
Reverse：GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA 58 23
Asc Forward：AACCCAAGCAAGATGCGGAAG 59 21
Reverse：TTAGGGCCTGGAGGAGCAAG 59 20
Il⁃1β Forward：CACGATGCACCTGTACGATCA 58 21
Reverse：GTTGCTCCATATCCTGTCCCT 57 21

1.2.3 外周血Caspase⁃1和IL⁃1β分泌水平测定 50 μL Assay Diluent、100 μL 梯度稀释的标准品和
收集血清：采集新鲜血液，4 ℃静置过夜，经 外周血原液，混匀后室温作用 1.5 h；弃掉反应板
3 000 g 4 ℃离心5 min，收集血清，用于Caspase⁃1和 内溶液，洗涤 3 次；加入 100 μL Conjugate solution，
IL⁃1β分泌水平测定。 室温作用 30 min；弃掉反应板内溶液，洗涤 3 次；加

IL⁃1β水平测定：向试剂盒孔板中依次加入200 μL 入 200 μL Substrate solution，室温作用 20 min；加入
梯度稀释的标准品和血清原液、50 μL anti⁃IL⁃1β 50 μL Stop solution，即刻置于540 nm处读取吸光度值，
HRP Conjugate solution，混匀后室温作用2 h；弃掉反 绘制标准曲线，计算外周血样本中Caspase⁃1水平。
应板内溶液，加入250 μL 1×Wash Buffer充分洗涤，重 1.3 统计学方法
复3次；加入200 μL TMB显色液，室温作用15 min；加 使用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。定量
入100 μL Stop solution，即刻置于450 nm处读取吸光 资料以均数±标准差（x ± s）表示，肺癌组和健康对照
度值，绘制标准曲线，计算外周血样本中IL⁃1β水平。 组之间的肺功能比较、外周血单核细胞中 NLRP3
Caspase⁃1水平测定：向试剂盒孔板中依次加入 炎性小体转录水平比较、血清 Caspase⁃1 和 IL⁃1β分