Page 29 - 南京医科大学自然版

第45卷第10期 裴雨晴，邵歆迪，朱煜洁，等. 基于秀丽线虫转基因株系探究牛蒡多糖对阿尔茨海默病的作
2025年10月 用及机制［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1395-1403 ·1397 ·

解液从线虫中获得同步的卵，然后移入 NGM 培养 并用 Image J 软件测量线虫体长和体宽 ［15］ 。每组测
［10］
基 ，培养 12~14 h 。将同期至 L1 期的 CL2006、 量30条线虫体长和体宽。实验重复3次。
CL4176、CL2122、CL2355、N2 线虫分为对照组和加 1.2.9 摆动次数的测定
药组，加药组的牛蒡多糖浓度分别为 62.5、125.0、 按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理，然后在平板
250.0 μg/mL。CL2006 线虫在 16 ℃下培养 48 h，后 上滴加适量 M9 缓冲液，待线虫恢复一段时间后开
在 25 ℃下培养 36 h。CL4176 线虫在 16 ℃下培养 始计数，观察 20 s 内线虫摆动的次数 ［16］ 。线虫身体
24 h，后在 25 ℃下培养 24 h。CL2122 和 CL2355 线 偏离中轴线摆向一侧后，再次回到中线时记 1 次。
虫在 16 ℃下培养 48 h，后在 25 ℃下培养 24 h。N2 每组记录30条线虫的摆动次数。实验重复3次。
线虫在20 ℃下培养48 h。 1.2.10 咽部震动次数的测定

1.2.4 Aβ荧光定量实验 按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理后，于体视显
按 1.2.3 对 CL2006 线虫进行处理后，每管加入 微镜下观察 20 s 内线虫咽部震动次数，每组记录
［17］
150 μL 4%多聚甲醛固定液，在4 ℃下固定24 h。然 30 条线虫的咽部震动次数 。实验重复3次。
后加入150 μL通透液，封口，37 ℃孵育24 h。M9溶 1.2.11 线虫体内 SOD 活性、MDA 和 ROS 含量以及
液清洗3次，再用50%乙醇冲洗3次，加入200 μL硫 AChE活性测定
磺素T染色剂 ［11］ 。后续继续用M9溶液冲洗至透明， 按1.2.3对CL4176线虫进行处理后，加入PBS并
加入1 000 μL M9溶液重悬线虫。制片后于荧光显 进行超声破碎，制备 10％线虫组织匀浆，取 0.1 mL
微镜下拍照并记录Aβ斑块数量。每组测定30条线 组织匀浆，按SOD、MDA试剂盒说明书操作，随后将样
虫的Aβ斑块数量。整体实验重复3次。 品置于酶标仪中，调定波长至 550 nm 测定吸光度。
1.2.5 趋化实验 另取 1 μL 组织匀浆，按 BCA 试剂盒说明书操作，
按 1.2.3 对 CL2122、CL2355 线虫进行处理后， 进行蛋白定量。取0.05 mL组织匀浆，按AChE试剂
在培养基中心滴加在 M9 溶液中浸泡 2 h 的线虫约 盒说明书操作，随后将样品置于酶标仪中，调定波
100条。吹干后，在一端滴加1 μL 趋化剂（1%丁二酮 长至 412 nm 测定吸光度。于荧光显微镜上拍照并
或0.1 mol/L NaCl）和1 μL 0.25 mol/L左旋咪唑，在另 用Image J软件对ROS进行定量 。实验重复3次。
［18］
一端滴加 1 μL M9 溶液和 1 μL 0.25 mol/L 左旋咪 1.2.12 基因表达定量分析
唑。将其置于25 ℃培养箱中1.5 h，记录每个培养基 按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理后，加入 1 mL
上线虫总数以及趋化圈中线虫数量 ［12］ 。整体实验 TRIzol 试剂和200 μL氯仿替代品，涡旋振荡并静置
重复3次。 10 min。加入 400 μL 异丙醇，并用 70%乙醇溶液洗
趋化指数=（丁二酮或NaCl侧线虫数-对照侧线 涤沉淀。获取纯化的RNA 后，使用FastKing 一步法
虫数）/培养基上线虫总数。 除基因组 cDNA 第一链合成预混试剂盒，进行逆转
1.2.6 5⁃羟色胺敏感性测定 录反应。最后，采用荧光染料法开展实时荧光定量
按1.2.3对CL2122、CL2355线虫进行处理后，每 PCR实验。实验重复3次。实验中使用的引物序列
个浓度挑取约100条线虫到NGM培养基上，然后滴加 详见表2。
5 mg/mL 5⁃羟色胺溶液。3 min 后评估线虫状态（活 1.3 统计学方法
跃或瘫痪），并记录未瘫痪的线虫数。计算每个浓度 实验结果用 SPSS 25.0 进行统计分析。数据用
［13］
未瘫痪的线虫数占总数的百分比 。实验重复3次。 均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用t检验，多
1.2.7 瘫痪实验 组比较采用方差分析，两两比较采用 SNK⁃q 检验。
按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理，每 4 h 评分， 采用log⁃rank 检验对线虫的瘫痪时间进行组间差异
根据 NGM 培养基上的铂金环不活动或线虫腹部存 分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
在群集卵的情况，评估线虫是否瘫痪 ［14］ ，并记录未
2 结 果
瘫痪的线虫数直至所有线虫均瘫痪。每组 50 条左
右。实验重复3次。 2.1 牛蒡多糖减轻线虫体内 Aβ的沉积，改善线虫

1.2.8 体长和体宽测定 对挥发性物质趋化的记忆，并改善Aβ蛋白引起的线
按 1.2.3 对 N2 线虫进行处理，加入左旋咪唑溶 虫神经元功能障碍
液麻醉线虫，待线虫不动时，于荧光显微镜下拍照 与对照组相比，加药组线虫体内 Aβ含量均显