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第45卷第10期          任言晖，徐可颖，张 伟，等. 成纤维细胞来源半乳糖凝集素⁃3通过细胞外基质蓄积促进矽
                 2025年10月               肺纤维化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1427-1434                  ·1429 ·


                1.2  方法                                           1.2.7 免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色
                1.2.1 肺纤维化动物模型构建                                      黏附有组织或ECM切片的玻片用PBS洗涤脱去
                    选取18~22 g的C57BL/6雄性小鼠，随机分为对                   OCT 胶，室温下 0.3%Triton X⁃100 覆盖组织 30 min，
                照组、SiO2暴露组，每组 3 只。小鼠使用 1%戊巴比                      10%正常山羊血清（normal goat serum，NGS）（NGS∶
                妥钠麻醉后固定于仰卧位，剔除颈部毛发，酒精棉                            0.3%Triton X⁃100=1∶9）封闭 2 h 后滴加抗 LGALS3
                球消毒手术部位，充分暴露气管，经气道滴注预备好                          （兔抗）、Vimentin（羊抗）（抗体∶10%NGS=1∶200）
                的 SiO2悬液（50 mg/mL，100 μL）和同体积的生理盐                 4 ℃过夜；次日玻片 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，滴
                水，缝合伤口。8周后麻醉处死所有小鼠，获取肺部组                          加488、546荧光标记二抗在室温孵育2 h，PBS 再次
                织以待后续实验研究。所有研究均已获得东南大学                            洗涤玻片，最后用 ddH2O 洗涤后晾干，DAPI 封片，
                动物伦理委员会审查批准（20200402024）。                         在激光共聚焦显微镜下完成拍摄。
                1.2.2 细胞培养                                        1.2.8 Western blot检测
                    HPF⁃α和 MLg 细胞培养于含 10% FBS、1%青霉                    收集TGF⁃β1刺激不同时间的细胞，PBS冲洗干
                素⁃链霉素和 1%谷氨酰胺的 DMEM 培养基中，置于                       净并使用 RIPA 裂解获取上清液，利用 BCA 蛋白定
                37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。细胞传代培养                       量试剂盒检测蛋白浓度。取20 μg蛋白经10%十二
                至对数生长期后用于后续实验。                                    烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质组分
                1.2.3 细胞模型构建                                      后，转印蛋白，PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭1 h后放
                    HPF⁃a 细胞消化离心，以 1×10 个/孔的密度铺                   入抗 LGALS3、GAPDH、β⁃actin 的一抗（1∶1 000 稀
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                入24孔板，37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养至合                      释）4 ℃过夜。次日加入1∶1 000稀释的辣根过氧化
                适状态，分别在 0、3、6、12、24、48 h 时间点，在处理                  物酶标记的山羊 IgG 二抗室温孵育 120 min，ECL 发
                组内加入TGF⁃β1（5 ng/mL）进行刺激。                          光液显影。小鼠肺组织取绿豆大小，加入300 μL裂
                1.2.4 ECM制备及脱细胞处理                                 解液于1.5 mL EP管中使用研磨仪研磨至匀浆状态，
                    将肺组织自-80 ℃冰箱中拿出，缓慢解冻至恢                        离心取上清，后续同细胞蛋白检测。
                复柔软放入包埋盒用OCT包埋，在冷冻冰切机中将                           1.2.9 单细胞转录组测序
                包埋组织切成180~200 μm的切片。将切片放入6孔                           将小鼠肺组织制成细胞悬液，交由北京博奥
                板内，倒入 1%SDS 溶液洗涤，1 h×3 次，室温震荡过                    晶典生物技术有限公司进行测序。原始测序数据
                夜；第 2 日弃去孔板内溶液，倒入 1% Triton X⁃100                 采用 Cell Ranger 4.0.0 软件进行处理，包括细胞条
                溶液洗涤，1 h×3 次，室温震荡过夜；第 3 日弃去孔                      形码识别、序列比对以及唯一分子标识符（unique
                板内溶液，PBS 洗涤 3 次，ddH2O 洗涤 6 次后，孔内                  molecular identifier，UMI）定 量 分 析 。 后 利 用 R
                加入 1%NaCl 溶液洗涤 1 h，再次用 PBS 及 ddH2O 各              v3.6.0 中的 Seurat 分析工具包对基因表达数据进行
                                                                  质控筛选和标准化处理。基于已知的细胞特异性
                洗涤 2 次；后加入 4 mL DNase（20 μg/mL）和 MgCl2
               （4.2 mmol/L）的混合溶液在 37 ℃孵育 1 h，再次用                  标志物，对不同细胞群体进行鉴定和分类，并最终
                ddH2O 洗涤；最后在无菌环境中加入 4.8%冰醋酸                       分为20个细胞群，具体见已发表文献［14］。
                溶液，在 37 ℃孵育 20 min，ddH2O 洗涤 3 次后，4 ℃              1.3 统计学方法
                保存。                                                   使用 GraphPad Prism 10.1.2 进行数据分析及作
                1.2.5 ECM细胞种植                                     图。2 组数据比较采用 t 检验，3 组及以上数据比较
                    将制备好的 ECM 取出置于 24 孔板底部，在                      采用方差分析，数据以均数±标准误（x ± sx）表示，

                37 ℃细胞培养箱内放置 1 h，MLg 细胞悬液（3×                      P < 0.05为差异有统计学意义。
                10 个/mL）小心滴在ECM上，约40 μL，放入细胞培养
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                箱等待细胞黏附后，继续培养72 h，以待后续实验。
                1.2.6 天狼星红染色                                      2.1  LGALS3参与ECM结合
                    肺组织在 4%多聚甲醛中固定过夜，使用蔗糖                             将小鼠肺组织细胞最终分为 20 个聚类，如图
                溶液梯度脱水，OCT 胶固定后在冰冻切片机中切成                          1A 所示。对成纤维细胞数量在各组别中的变化进
                8 μm 的切片。采用天狼星红染色试剂盒说明书步                          行可视化分析，发现其在SiO2处理 56 d时数量明显
                骤染色，无水乙醇脱水并固定，中性树脂封片。                             增加（图1B）。因此，进一步分析了成纤维细胞在生
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