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第45卷第10期 王乙淼，王 泽，佘雨竹，等. 丰富环境改善5×FAD小鼠社会行为障碍［J］.
2025年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1375-1385 ·1377 ·

鼠饲养在恒定温度（20~26 ℃）和湿度（30%~70%）的 在装置中，自由活动 5 min，记录其进入开放臂的次
环境中，在12 h的光照/黑暗循环下，可以自由获取食 数以及在开放臂内的停留时间。
物和水。所有动物实验均按照南京医科大学实验动 三箱社交实验：三箱社交实验用于评估小鼠的社
物护理和使用指南进行（伦理编号：1812054⁃4）。 交偏好及社交记忆能力。实验装置由 3 个大小相
1.1.2 试剂与器材 同的矩形室组成，每个室的尺寸为 40 cm×40 cm×
突触后致密蛋白95（post⁃synaptic density protein 30 cm。相邻的两个室通过有机玻璃墙隔开，并在墙
95，PSD⁃95）、髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein， 上开设矩形通道（8 cm×8 cm），允许小鼠自由出入。

MBP）、胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白（glial fibrillary acidic 实验中，使用金属笼隔离 1 只同性别、同基因型背
protein，GFAP）、神经元细胞核（neuronal nuclei，NeuN） 景，以及年龄相近的陌生小鼠，两侧分别放置1个金
抗体（Abcam 公司，美国）；突触素（synaptophysin， 属笼。实验分为3个阶段：第1阶段为适应期，小鼠

SYP）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phos⁃ 在装置中自由探索10 min；第2阶段评估社交偏好，
phate dehydrogenase，GAPDH）（武 汉 Proteintech 公 将 1 只陌生小鼠（stranger 1）置于一侧的金属笼内，

司）；离子钙结合适配蛋白1（ionized calcium⁃binding 被测小鼠自由探索5 min；第3阶段评估社交记忆，在
adapter molecule 1，Iba1）（WAKO 公司，日本）；DAB 另一侧金属笼内放入另一只陌生小鼠（stranger 2），小
显色液（南京凯基生物）；β⁃淀粉样蛋白 1⁃16（anti⁃ 鼠再次探索 5 min。通过记录实验小鼠在各阶段于
β⁃amyloid，1⁃16，6E10）（Biolegend公司，美国）；Western 不同区域的停留时间，分析其社交能力。
blot 实验与免疫组化实验中兔二抗和大鼠二抗（北 1.2.2 取材与脑组织制备
京中杉金桥公司）；免疫荧光实验中兔二抗、大鼠二 对实验小鼠进行腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和
抗和小鼠二抗（Thermo Fisher Scientific公司，美国）； 甲苯噻嗪（8 mg/kg）进行麻醉，在药物充分发挥作用
硫磺素S（SIGMA公司，美国）；超薄切片机（EM UC7） 后，使用 0.01 mol/L 的磷酸缓冲盐溶液（phosphate⁃
（Leica 公司，德国）；电子显微镜（Tecnai G2）（FEI 公 buffered saline，PBS）通过心脏灌注，直到肝脏呈现
司，美国）。 无血色状态。随后，将脑组织收集到 EP 管中，并立
1.2 方法 即置于液氮中冷冻，保存于-80 ℃以用于后续的蛋
1.2.1 行为学测试 白免疫印迹实验。对于免疫组化和免疫荧光实验，
Y迷宫：Y型迷宫测试利用1个由3个臂组成的 待肝脏无血色后，改用 4%PFA 溶液继续灌注 5 min
Y 形迷宫（尺寸为 30 cm×15 cm×8 cm，夹角为 120°） 以固定组织，然后将组织储存在4%多聚甲醛（para⁃
来评估小鼠的短期工作记忆能力。测试包括训练 formaldehyde，PFA）中，在 4 ℃下固定 12 h。石蜡切
阶段和测试阶段，两阶段间隔 1~2 h。在训练阶段， 片的制备过程包括：将固定后的脑组织在梯度乙醇
通过木板封闭新奇臂，仅允许小鼠在剩余两个臂内 中脱水，接着用二甲苯和石蜡处理，最终进行石蜡包
自由活动5 min；而在测试阶段，打开新奇臂，小鼠可 埋，并使用石蜡切片机制作出5 μm厚的连续切片。
以自由探索所有臂，同样持续 5 min。实验过程中， 对于冰冻切片制备，先将固定后的脑组织分别用
利用跟踪软件（TopScan，CleverSys，Inc.，美国）记录 20%和 30%的蔗糖溶液进行梯度脱水处理，再用
小鼠进入新奇臂的次数及探索时间。 OCT 胶包埋，使用徕卡切片机制作 20 μm 厚的切
旷场实验：旷场实验用于评估小鼠的整体运动活 片。在进行后续操作之前，石蜡切片需要经过烘片
性、焦虑水平和探索行为。实验中，将单只小鼠置于 和脱蜡处理，而冰冻切片则需在 PBS 中清洗后贴附
一个封闭的平台内（尺寸为60 cm×60 cm×25 cm），并 于玻片上，晾干后立即进行后续实验步骤。
让其自由活动5 min。通过高架摄像机记录小鼠的移 1.2.3 硫磺素⁃S染色
动距离、在中心区域（30 cm×30 cm）的停留时间、进入 硫磺素⁃S是一种标准的荧光染色剂，它能够特
中心区域的次数，以及实验期间的粪便数和尿液数。 异性地结合淀粉样蛋白沉积物。本研究采用硫磺
十字高架实验：十字高架实验是一种用于评估 素对Aβ斑块进行了分析。具体操作为：对脱蜡并水
小鼠焦虑行为的经典行为学测试方法。实验装置 化的组织切片使用 0.1%的硫磺素 S 进行避光染色
包括一个中央平台（10 cm×10 cm），连接两个开放臂 5 min，接着用流水冲洗5 min，再用70%酒精进行分
（50 cm×10 cm）和两个封闭臂（50 cm×10 cm×40 cm）， 色处理5 min，最后封片并在荧光显微镜下进行观察
整体高度距地面100 cm。实验过程中，小鼠被放置 和拍摄。