Page 10 - 南京医科大学自然版
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第45卷第10期
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              1.2.4 免疫组化染色和免疫荧光染色                               白裂解液中加入上样缓冲液，95 ℃金属浴加热蛋白
                  石蜡切片在脱蜡水化后，需通过枸橼酸钠修复                          5 min，冷却后保存于-20 ℃。将20~30 μg蛋白样品
              液微波修复15 min，修复完毕后，脑片在修复液中自                        加入10%~15%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上，首先使用
              然降至室温。冷却后的切片用 PBS 清洗 3 次，每次                       80 V 恒压电泳 35 min 分离蛋白 Marker，随后 120 V
              5 min。免疫组化染色时，使用 3%H2O2对清洗后的                      恒压电泳 60 min。电泳结束后将凝胶上的蛋白以
              切片灭活 15 min，随后 PBS 清洗 3 次，每次 5 min。               300 mA 恒流转移至 PVDF 膜上。转膜完成后用 5%
              PBS配置的5%BSA封闭1 h后，加入一抗4 ℃孵育过                      脱脂奶粉/TBST 进行封闭 1 h，根据目的蛋白分子

              夜。一抗：PSD⁃95（1∶200），SYP（1∶800）。次日PBS               量对 PVDF 膜进行剪裁，与各自一抗在 4 ℃孵育
              洗净一抗，加入对应的二抗 37 ℃孵育 1 h。弃去二                       过夜。一抗：PSD⁃95（1∶1 000）；SYP（1∶8 000）；
              抗后 PBS 清洗切片 3 次，每次 10 min。随后配制                    MBP（1∶1 000）。次日用 TBST 溶液洗 3 次，每次
              DAB显色液避光显色，镜下观察显色情况并控制显                           10 min，随后将膜与相应辣根过氧化物酶标记的二
              色条件一致。显色完成后，PBS清洗切片，经过梯度                          抗室温孵育1 h后，TBST溶液充分清洗，使用增强型
              酒精脱水和二甲苯透明后用中性树脂封片。自然                             ECL 对蛋白印记进行可视化处理。实验中均以
              晾干后使用显微镜拍摄。进行免疫荧光染色时，对                            GAPDH作为蛋白的内参。
              冷却后清洗完毕的切片直接使用 5%BSA 封闭 1 h，                      1.3  统计学方法
              弃去后加入一抗4 ℃孵育过夜。一抗：GFAP（1∶200），                         采用Prism 8.0（GraphPad Software，USA）软件执
              Iba1（1∶200），MBP（1∶200）。洗去一抗后加入相应                  行统计学分析。数据以均值±标准误（x ± Sx）表示，
              的二抗，室温避光孵育 2 h。结束后清洗切片 3 次，                       两组样本数据通过 Student’s t 检验进行分析，P <
              10 min/次，用 PBS 溶液 1∶1 000 配置的 4，6⁃二脒基⁃            0.05表示差异有统计学意义。
              2⁃苯基吲哚（4，6⁃diamidino⁃2⁃phenylindole，DAPI）对
                                                                2  结 果
              细胞核染色10 min，在PBS清洗后封片。
              1.2.5 透射电镜                                        2.1  EE改善5×FAD小鼠的社交行为障碍
                  对麻醉小鼠实施0.01 mol/L PBS灌注，以清除脑                       为探究EE对AD样病理生理进程的影响，本研
              组织中的血液，接着使用4% PFA溶液灌注7 min以                       究将 2 月龄的 5×FAD 小鼠随机分成 SE 和 EE 组。
              固定组织。取出脑组织，分离出 mPFC 区域，并在                         饲养 4 周至 3 月龄后，进行行为学和病理组织学分
              2.5%戊二醛中于 4 ℃条件下进行为期一周的后固                         析（图 1A）。通过 Y 迷宫实验测试评估各组小鼠的
              定。经PBS清洗后，脑组织在0.5%醋酸铀和75%乙                        短期空间记忆能力，结果显示，与SE组小鼠相比，给
              醇溶液中孵育1 h，再依次进行乙醇梯度脱水和环氧                          予EE刺激后的小鼠在新奇臂内停留时间和进入次
              丙烷渗透处理后，进行Epon包埋，并在60 ℃温箱中                        数没有显著增加（图1B）。同时，通过十字高架实验
              孵育24 h。对Epon包埋组织进行修剪与重新定位，                        和旷场实验评估小鼠焦虑样表型，结果显示 EE 组
              使用超薄切片机制作 70 nm 厚度的切片。最后，通                        小鼠在十字高架的开放臂内停留时间百分比和进
              过 FEI Tecnai G2 电子显微镜在 120 kV 的加速电压               入次数与 SE 组相比，差异无统计学意义（图 1C）。
              下观察样品。                                            旷场实验也证实 EE 对其探索活动并无影响，表现
              1.2.6 蛋白质免疫印迹实验                                   为在中心区域停留的时间和进入次数差异无统计
                  在冰盒上切取mPFC脑区于EP管中，完全浸没                        学意义（图1D）。
              于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 蛋白                               本研究进一步通过三箱实验来探究 EE 对 5×
              裂解液中，加入钢珠后使用匀浆机剧烈匀浆，取出                            FAD 小鼠的社会交往行为的影响。三箱实验结果
              EP管插于冰上摇床快摇30 min使其充分裂解，随后                        表明，3 月龄的 5×FAD 小鼠在社会交往能力存在缺
              吸出钢珠，以 12 000 r/min 转速离心 15 min，吸取上               陷，表现为在 Stranger 1 室停留的时间百分比低于
              清液。对于细胞，直接向孔板中加入裂解液，使用                            Empty 室停留的时间百分比；同时也表现为社交记
              细胞刮将细胞收集于EP管中并插入冰上，置于摇床                           忆的障碍，表现为在Stranger 2室停留的时间百分比
              快摇 30 min 后，以 12 000 r/min 转速离心 15 min，吸          低于Stranger 1室停留的时间百分比。EE干预明显
              取上清液。记录每个样品上清液的体积。使用                              改善了5×FAD 小鼠的社交表现（图1E、F）。综上所
              BCA 试剂盒进行蛋白定量，计算浓度，并向剩余蛋                          述，EE并未对SE⁃5×FAD 小鼠的认知功能和焦虑样
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