Page 8 - 南京医科大学自然版
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第45卷第2期
               ·148 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年2月


                  乳腺癌是全球女性发病率和病死率最高的恶                           serum，FBS）、PRIM 1640和PBS（Sigma公司，美国）。
              性肿瘤   ［1-2］ ，严重威胁患者生命健康。乳腺癌具有明                         乳腺组织标本源于重庆大学附属肿瘤医院住
              显的异质性     ［3-5］ ：可分为多个分子亚型，不同亚型之                  院患者（入院时统一签署知情同意书，经医院伦理
              间的临床和病理特征各不相同，在治疗敏感性、基                            委员会批准），其中乳腺癌 20 例（Luminal A、Lumi⁃
              因表达、浸润转移、生存预后等方面存在很大差                             nal B、HER2、三阴性乳腺癌，每个亚型5例）、乳腺纤
              异。目前临床将乳腺癌分为 Luminal A、Luminal B、                 维腺瘤2例、正常乳腺组织2例。
              HER2 型和三阴性型等分子亚型，并根据各亚型的                          1.2  方法
              特征进行个体化治疗，包括手术、化疗、放疗、内分                           1.2.1 DNA序列合成与纯化
              泌治疗和分子靶向治疗。乳腺癌的异质性增加了                                  随 机 DNA 库 序 列（5′ ⁃ ATACCAGCTTATTCA
              诊断治疗的难度，探究能够同时结合乳腺癌细胞多                            ATT⁃52⁃NT⁃AGATAGTAAGTGCAATCT⁃3′）；异硫氰
              个分子亚型的抗体类似物，将有助于进一步提高肿                            酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记引物
              瘤识别和分子治疗的效率。                                     （5′⁃FITC⁃ATACCAGCTTATTCAATT⁃3′）；生物素标

                  近年来，采用指数富集的配体进化系统（sys⁃                        记引物（5′⁃trB⁃AGATTGCACTTACTATCT⁃3′）。以上
              tematic evolution of ligands by exponential enrich⁃  DNA序列由上海生工公司进行人工合成、高效液相
              ment，SELEX）技术成功筛选了肿瘤细胞特异性的核                       色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）
              酸适配子    ［6-8］ ，有望用于肿瘤筛查、诊断、治疗、监测                  纯化和DNA定量分析。
              和研究等。研究发现，采用细胞⁃SELEX筛选的乳腺                         1.2.2 dsDNA库和ssDNA库的制备
              癌细胞特异性 DNA 适配子具有识别乳腺癌亚型细                               参考文献［14］，以FITC标记引物和生物素标记
              胞的功能 ，这提示采用细胞⁃SELEX技术获取的适                         引物进行PCR扩增，PCR产物即为双链DNA（double
                      ［9］
              配子具有细胞水平的特异性；如果以多种亚型的乳                            ⁃stranded DNA，dsDNA）库。将 dsDNA 库置于碱性
              腺癌细胞为靶标进行SELEX筛选，就可能获取同时                          环境（0.2 mol/L NaOH）经 95 ℃变性5 min后；再用卵
              识别一种以上乳腺癌亚型细胞的适配子，从而有利于                           白素包被的琼脂糖珠分离，以去除生物素化引物所
              提高乳腺癌的诊断和治疗效率。另一方面，不同分子                           在的反义 DNA 单链，保留 FITC 标记引物所在的正
              亚型的乳腺癌有相应的细胞株             ［10-11］ ，也为筛选识别多        义单链，从而获得单链 DNA（single⁃stranded DNA，
              种乳腺癌细胞的适配子研究提供了可能。                                ssDNA）库，即原始库。PCR 的扩增效果通过 3%琼
                  近年来，尽管细胞⁃SELEX技术本身取得了较大                       脂糖凝胶电泳进行鉴定，并以此来优化PCR反应的
              发展、建立了多种复杂的 SELEX 筛选方法                ［12-13］ ，但  条件。
              目前尚未发现与本研究方法类似的报道。本研究                             1.2.3 细胞培养
              以细胞⁃SELEX技术为基础，采用不同分子亚型乳腺                              人乳腺癌细胞 MCF⁃7 和 MDA⁃MB⁃231，以及正
              癌对应的细胞株作为靶标，进行交叉串联细胞⁃                             常人乳腺上皮细胞MCF⁃10A，采用常规细胞培养液
              SELEX筛选，最终获取能与不同亚型乳腺癌细胞高                         （PRIM 1640+10%FBS+100 U/mL青⁃链霉素）培养于
              特异性、高亲和力结合的 DNA 适配子，为乳腺癌的                         37 ℃、5%CO2孵箱；细胞生长至对数生长期时，用
              诊断和治疗研究提供一种新的思路和方法。                               洗脱液（PBS+5 g/L 糖+5 mmol/L MgCl2）洗涤 3 次，
                                                                并进行靶细胞和对照细胞的计数、活力检测，备筛
              1  材料和方法
                                                                选之用。
              1.1  材料                                           1.2.4 交叉进行的乳腺细胞⁃SELEX筛选
                  人乳腺癌细胞MCF⁃7和MDA⁃MB⁃231以及正常                         采用常规细胞培养技术，大量培养乳腺癌细胞
              乳腺上皮细胞 MCF⁃10A（ATCC，美国）；大肠杆菌                      株和正常乳腺上皮细胞株；待细胞进入对数生长
              DH5α菌株由第三军医大学实验中心提供；卵白素                           期后，用于交叉串联细胞⁃SELEX 筛选。每次筛选

              包被的琼脂糖珠（Amersham Pharmacia Biosciences            前，需注意细胞状态良好、清除死细胞和确保细胞
              公司，美国）；PCR试剂盒及相关酶（TaKaRa公司，日                      无污染。
              本）；pUC⁃T simple TA 连接试剂盒（北京康为世纪                        筛选流程：通过预实验确定 3 种细胞交叉串联
              生物科技有限公司）；酵母 tRNA、牛血清白蛋白                          SELEX 筛选方法，包括 2 种乳腺癌细胞的交叉正筛
             （bovine serum albumin，BSA）、胎牛血清（fetal bovine       选、1 种正常乳腺细胞的负筛选；正筛选部分，每个
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