Page 9 - 南京医科大学自然版

第45卷第2期 潘先均，刘 美，李光新，等. SELEX技术筛选乳腺癌亚型组织细胞的DNA适配子［J］.
2025年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（2）：147-156 ·149 ·

小循环的筛选流程均进行 2 轮筛选，之后进入下一 子的富集效率。
个小循环的筛选；所有正筛选流程进行完毕，最后 1.2.6 适配子与乳腺癌细胞的亲和力分析
完成2轮负筛选。 人乳腺癌细胞 MCF⁃7 和 MDA⁃MB⁃231，以及正
正筛选：取 200 pmol 单链 ssDNA 库溶于 400 μL 常人乳腺上皮细胞MCF⁃10A消化处理、置12孔板爬
结合液［洗脱液+0.1 mg/mL 酵母 tRNA+1 mg/mL 片，37 ℃ 5%CO2温箱培养 24 h；PBS 漂洗细胞 2 次，
BSA］；95 ℃ 5 min 变性，冰上放置 10 min；将 ssDNA 每次 5 min；5%多聚甲醛室温固定 15 min；PBS 漂洗
库与1×10 ~2×10 个第1种靶细胞（MCF⁃7）共孵育于 2 次，每次 5 min；取 10 μg（原始库 34 μL、22 级库
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冰上60 min；洗涤细胞、离心后，用300 μL结合液重 28 μL）ssDNA 与爬片 4 ℃结合过夜（ssDNA 处理：
悬细胞，95 ℃加热 5 min 以便将结合于靶细胞的 95 ℃变性 5 min，冰上放置 10 min）；PBS 漂洗细胞
ssDNA 充分洗脱；共完成 2 轮筛选。采用同样的方 2 次，每次 5 min；DAPI 染色 10 min，封片，激光共聚
法进行第2种靶细胞（MDA⁃MB⁃231）的正筛选。 焦显微镜观察。
负筛选：将洗脱的ssDNA 与乳腺正常对照细胞 1.2.7 适配子的TA克隆、测序、序列分析与初步筛选
（MCF⁃10A，数量为靶细胞的 5 倍）共孵育于冰上 第22轮筛选所获的适配子经PCR扩增、产物回
60 min；离心、取上清液，对获得的 ssDNA 进行脱盐 收纯化；按照pUC⁃T simple TA连接试剂盒的说明书
处理。 进行适配子的TA载体克隆；随机挑选100个阳性克
富集库的 PCR 扩增及条件优化：以经过正、负 隆送上海生工公司测序；用 DNASTAR.Lasergene.
筛选获取的ssDNA为模板，以生物素及FITC标记的 v7.1软件识别和查找有效序列；采用精确比对法，在
引物进行 PCR 扩增（10~20 个循环 94 ℃ 0.5 min； NCBI网站提供的Blastn程序比对人、小鼠的编码核
46 ℃ 0.5 min；72 ℃ 0.5 min；72 ℃ 5 min）；扩增后的 酸数据库和其他非编码数据库。
PCR 产物用卵白素包被的琼脂糖珠去除生物素标 1.2.8 适配子的肿瘤特异性分析与优选研究
记的反义链 ssDNA，从而获得 FITC 标记的正义链 采用FCM进行分析，参照1.2.5。观察对比适配
ssDNA，即所谓富集库（适配子），用于后续筛选。按 子与各细胞结合的荧光强度：人乳腺癌细胞SKBR3、
常规PCR退火温度条件不能获得预期PCR产物，需 MCF⁃7 和 MDA⁃MB⁃231，正常人乳腺细胞MCF⁃10A，
采用温度梯度PCR实验确定最适温度，温度梯度为 以及非乳腺来源的腺癌细胞SGC⁃7901、A549、SW480、
0.5 ℃，确定最适退火温度。 A2780、HepG2和PANC⁃1。
重复筛选：以富集库进行下一轮筛选，方法同 1.2.9 适配子与乳腺癌细胞的结合
上，重复筛选20轮；其中第1轮筛选以原始库ssDNA 采用激光共聚焦显微分析法，参照1.2.6。特异
为 10 nmol 溶于 1 mL 结合液开始，不进行反向筛选 性最高的优选适配子经FITC标记，激光共聚焦显微
（旨在将结合库放大）。为获取高特异性、高亲和力 观察与乳腺癌细胞株的体外结合情况。
适配子，可采用以下策略：逐渐延长洗涤时间（1→ 1.2.10 适配子与临床乳腺癌组织的结合
10 min）、增加洗涤液体积（0.5→5 mL）、增加洗涤次 采用免疫荧光染色方法，取乳腺癌组织、乳腺显
数（3→5 次）；此外，孵育液中还可加入 20%FBS 及 微腺瘤组织和乳腺正常组织蜡块，常规切片、3 μm连
50~100 倍摩尔数的基因组DNA；其中最后一轮筛选 续切片、防脱片，60 ℃过夜烤片、抗原修复、恢复至室
后，所获ssDNA进行PCR时采用非标记引物，扩增产 温，PBS洗涤3次，每次5 min；封闭60 min（含鲑鱼精
物以TA载体克隆到大肠杆菌，进行克隆测序分析。 DNA 0.1 mg/mL，tRNA 0.1 mg/mL，BAS 1%，0.02%
1.2.5 适配子富集效率的监测 Tween⁃20 的 PBS 封 闭 液 ），加 50 μ L 250 nmol/L
FITC 标记的 ssDNA 富集库（适配子）与两种乳 荧光适配子探针（FITC 标记的目标探针和对照
腺癌细胞（2×10 个，作为靶细胞）、对照细胞共孵育 探针）、避光 4 ℃ 1 h；PBS 洗涤 5 次；盖玻片封片，
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于 200 μL 含 20%FBS 的结合液；冰上放置 50 min 令 荧光显微镜观察适配子与临床组织标本的结合
其充分结合；以0.7 mL结合液（含0.1%的NaN3）洗涤 情况。
2 次；以 0.4 mL 结合液（含 0.1%的 NaN3）重悬；经流
2 结 果
式细胞术（flow cytometry，FCM）计数 30 000 个细胞
的平均荧光强度；以FITC标记的ssDNA初始库与靶 2.1 DNA库及PCR扩增条件的优化
细胞结合作为背景荧光，计算每一轮筛选所获适配 通过PCR扩增建立初始dsDNA文库，扩增产物