Page 10 - 南京医科大学自然版

第45卷第2期
·150 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2025年2月

相对分子量符合设计要求（图 1），通过梯度实验确 10个循环的产物条带清晰、单一，扩增30个循环时，
定 PCR 扩增条件。初始 dsDNA 库经卵白素包被的 电泳没有检测到预期的目标条带（图1B），提示PCR
琼脂糖珠分离、去掉生物素化引物所在的反义单 扩增的循环次数不能高于 30；第 1 轮筛选的次级库
链，保留 FITC 标记引物所在的正义单链，从而建立 ssDNA 稀释 10 倍后 PCR 产物条带更清晰、更特异
初始ssDNA库，用于后续的筛选实验。 （图 1C、D）。因此，退火温度 52.7 ℃时原始库 PCR
梯度实验琼脂糖电泳：原始DNA库最佳退火温 扩增条带清晰（图1E）、一级库ssDNA条带基本清晰
度为 51~52.7 ℃（图 1A）；以 ssDNA 为模板 PCR 扩增 （图1F）。

A B C
（bp） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 （bp） M 1 2 M 1 3 4 5 （bp） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213

500
500 200
500 —88 bp
200 —88 bp 200 —88 bp 100
100 100 50
50 50
D E F
（bp） M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 （bp） M Control PCR （bp） M Control PCR

500
200 500 500
100 —88 bp 200 200
50 100 —88 bp 100 —88 bp
50 50

A：Temperature gradient experiment for original DNA library（M：DNA marker；1-12：Temperature gradient from 49.0 ℃ to 67.0 ℃）. B：PCR pro⁃
duct from different cycle⁃index of amplification（M：DNA marker；1：control；2：ssDNA template；3：30 cycles；4-5：10 cycles）. C，D：Original ssDNA
（C）vs. ten fold diluted original ssDNA（D）as PCR template（M：DNA marker；1-12：Temperature gradient from 49.0 ℃ to 67.0 ℃；13：Control）. E：ds⁃
DNA amplified by PCR of original library. F：ssDNA amplified by PCR of first round screening library.
图1 DNA随机文库的建立及PCR扩增条件优化
Figure 1 Establishment of DNA random library and optimization of PCR amplification conditions

2.2 交叉串联细胞⁃SELEX筛选流程 有逐渐清晰、集中的趋势，但并不明显（图3B）；③适
预实验发现，如果采用 MCF⁃7、MDA⁃MB⁃231、 配子亲和力监测：采用 MCF⁃7、MDA⁃MB⁃231、MCF⁃
MCF⁃10A 依次顺序筛选，DNA 适配子得率非常低 10A细胞进行交叉串联细胞⁃SELEX筛选，每一轮筛
（数据未发表）；改用MCF⁃7和MDA⁃MB⁃231两个靶 选后经 FCM 检测适配子平均荧光强度（即富集效
细胞交叉、串联筛选，可以提高DNA适配子得率；最 率、亲和力），随着筛选不断进行，平均荧光强度出
后进行乳腺细胞MCF⁃10A负筛选。交叉串联细胞⁃ 现逐渐增高趋势；采用 MCF⁃7 和 MDA⁃MB⁃231 各完
SELEX 筛选流程：每种细胞进行连续 2 轮筛选后更 成 10 轮筛选后，平均荧光强度曲线出现交叉点（图
换成另外一种细胞继续筛选（图2，表1）。 3C），继续筛选虽可进一步提高适配子对 MDA⁃MB⁃

2.3 交叉串联细胞⁃CELEX 法筛选乳腺癌细胞的 231 细胞的亲和力，但适配子对 MCF⁃7 细胞的亲和
DNA适配子 力可能下降，提示如果继续筛选，适配子对2种细胞

交叉串联细胞⁃SELEX筛选有3个关键点。①PCR 的亲和力将出现分离，遂停止筛选。
退火温度（Tm）：常规细胞⁃SELEX筛选过程一般具有 2.4 初筛的DNA适配子与乳腺细胞的亲和力检测
相同Tm值，本研究原始DNA文库扩增以及每一轮筛 完成20轮正筛选和2轮负筛选后，取荧光标记
选所需Tm并不完全一致，需通过温度梯度实验逐一 适配子与细胞结合。激光共聚焦显示适配子（22级
确定，前10轮筛选Tm波动较大，10轮以后Tm相对稳 库 ssDNA）与乳腺癌细胞 MDA⁃MB⁃231 和 MCF⁃7 的
定（图 3A），可能与适配子特异性逐渐升高有关； 结合明显强于 0 级库，与乳腺细胞 MCF⁃10A 结合弱
②PCR产物电泳：随着筛选不断进行，PCR电泳条带 于0级库（图4）。