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第45卷第7期 谢萧屹，汪心婕，戎 誉，等. 广谱铜绿假单胞菌噬菌体PAPX的生物学特性及生物膜清除能
2025年7月 力的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（7）：945-953 ·947 ·

滤纸过滤后，在4 ℃下以 8 000 g离心10 min以去除 评估噬菌体的热稳定性。
碎片。上清液经 0.45 μm 无菌膜过滤后，与铜绿假 1.2.5 噬菌体基因组提取、测序及生物信息学分析
单胞菌过夜培养物一起在37 ℃下培养，以扩增噬菌 使用病毒 DNA/RNA 提取试剂盒提取噬菌体的
体种群。再次过滤并储存培养物的上清液，以备进 基因组DNA，其二代全基因组测序及拼接由上海派
一步分析。接着进行噬菌体纯化以分离单个噬菌 森诺生物科技有限公司完成。基于Illumina NovaSeq
体。将 100 μL 富集的噬菌体溶液与 100 μL 过夜铜 平台上进行测序，并使用A5⁃MiSeq和SPAdes工具将
绿假单胞菌培养物混合，再加入4 mL半固体BHI培 原始数据组装成基因组信息。使用BLAST 将高覆盖
养基。将混合物覆盖在 BHI 琼脂平板上，37 ℃培养 序列与NCBI NT数据库进行比对，以确认噬菌体基因
过夜。分离出单个斑块，将其转移到装有 SM 缓冲 组的同一性。使用MUMmer软件和Pilon软件进一步
液的试管中，并通过数次重复纯化，以确保噬菌斑 完善等位基因，以生成最终的基因组组装 ［17-18］ 。基因

大小的均匀稳定性。为了浓缩噬菌体，将 200 mL 注释采用 DIAMOND 软件，使用 NCBI NR 数据库进
噬菌体感染的细菌培养物与等体积的 10%聚乙二 行蛋白质功能预测，显著性阈值为 1×10 -6［19］ 。最终
醇8000（PEG8000）在 4 ℃ 下混合过夜。10 000 g离 将获得的噬菌体基因组序列提交 GenBank，获得登
心 10 min 后，将颗粒重悬于 SM 缓冲液中并用氯仿 录号PV189959。
萃取，得到的含有噬菌体的上清液储存在 4 ℃以备 1.2.6 噬菌体最佳感染复数及一步生长曲线
进一步实验。 使铜绿假单胞菌培养物生长至对数期（D（600 nm）=
1.2.2 噬菌体宿主菌谱实验 0.6，约1×10 CFU/mL），以确定最佳感染复数（multi⁃
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通过斑点实验评估分离出的噬菌体的宿主范 plicity of infection，MOI）。将连续稀释的噬菌体与细
围。耐多药铜绿假单胞菌菌株来自江苏省妇幼保健 菌培养物混合，在37 ℃ 温度下培养4 h，振荡频率为
院检验科细菌库。将这些菌株的隔夜培养物与半固 180 r/min。采用双层琼脂法测定上清液中的噬菌体
体BHI培养基混合，倒入BHI固体平板，在室温下凝 滴度。产生最高噬菌体滴度的MOI被确定为最佳。
固。然后将5 μL浓度约为1×10 PFU/mL的噬菌体上 利用噬菌体感染处于对数生长期的铜绿假单
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清液，滴加到平板上。干燥后，将平板在37 ℃下培养 胞菌（MOI=10），绘制一步生长曲线。混合物在
过夜，评估裂解区以确定噬菌体的敏感性。 37 ℃培养箱温育15 min，以确保每个细菌都被噬菌
1.2.3 噬菌体的形态学观察 体侵染，然后12 000 r/min离心30 s，尽量弃去上清，
通过双层琼脂平板法，噬菌体能在上层半固体 此时看不到菌体沉淀。每管加入适量BHI培养基再
培养基中显示出单个噬斑的形态。使用透射电子 12 000 r/min 30 s离心弃去上清，重复2次，充分洗去
显微镜观察分离出的噬菌体的形态结构，将 10 μL 或者稀释未吸附的噬菌体。接着用预热的BHI培养
纯化的噬菌体悬浮液（浓度约1×10 PFU/mL）涂抹在 基混悬两个EP管底的细菌沉淀并将其充分混匀，转
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带碳支撑膜的铜网上，室温晾干后用2%磷钨酸染液 移到一个新的10 mL EP管中，迅速置于37 ℃摇床中
进行复染。10 min后，吸去多余的染液并晾干 。使 160 r/min 振荡培养，同时开始计时。每 10 min 取样
［16］
用 Thermo Scientific Helios 5 Hydra DualBeam TEM 1 次。离心样品，测定上清液中的噬菌体滴度。噬
对制备好的样品进行观察。 菌体滴度与时间的关系曲线揭示了潜伏期、暴发大
1.2.4 噬菌体的pH稳定性及温度稳定性检测 小和暴发持续时间等关键参数。

使 用 不 同 pH 值 的 磷 酸 盐 缓 冲 液（phosphate 1.2.7 体外抑菌曲线
buffered saline，PBS）将纯化的噬菌体溶液（浓度约 在24孔板中进行体外抑菌实验，评估噬菌体的
为1×10 PFU/mL）稀释10倍。然后将稀释样品在室 杀菌能力，取铜绿假单胞菌标准株在 BHI 培养基中
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温下培养 1 h，以评估该噬菌体对不同 pH 溶液的稳 培养至D（600 nm）=0.2。以最佳MOI加入噬菌体溶
定性。共培养结束后，使用双层琼脂平板法测定噬 液，对照孔加入等量的 BHI 培养基。使用 Biotek
菌体滴度。 SynergyMX 酶 标 仪 在 10 h 内 每 隔 1 h 记 录 1 次
在进行热稳定性分析时，将噬菌体溶液（浓度 D（600 nm）测量值。对数据进行统计分析，结果以
为 1×10 PFU/mL）置于 37 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃ 和 均值±标准差（standard deviation，SD）的形式报告。
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75 ℃的水浴锅中，并在这些温度下保持 1 h。共培 为了比较两组之间的统计差异，采用了双向方差分
养结束后，使用双层琼脂平板法测噬菌体浓度，以 析。统计显著性的标准是P < 0.05。