Page 38 - 南京医科大学自然版
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第45卷第8期
               ·1094 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年8月


              A11707）（武 汉 爱 博 泰 克 生 物 科 技 有 限 公 司）；             小板。
                   phox  359                         phox  抗体          血浆TC、TG、HDL⁃C和LDL⁃C的检测
              p⁃p47 （Ser ）抗体（货号：AF3167）和 p47                    1.2.3
             （货号：AF5220）（Affinity Biosciences 公司，美国）；藻               将冻存的血浆从冰箱中取出，置于冰上，使其
              红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的鼠 CD62P 流式抗               自然溶解后，依照试剂盒说明书检测血浆 TC、TG、
                                                                                   ［17］
              体（货号：12⁃0626⁃82，eBioscience 公司，美国）；BCA            HDL⁃C和LDL⁃C水平 。
              蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0011，上海碧云天生                         1.2.4  血小板聚集实验
              物技术股份有限公司）；总胆固醇（total cholesterol，                     用台氏液调整纯化血小板密度至2.5×10 个/mL，
                                                                                                       8
              TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固                将250 μL血小板悬液加入反应杯中，在聚集仪孵育
              醇（high⁃density lipoprotein⁃cholesterol，HDL⁃C）和低   孔中预热5 min，同时加入终浓度为1 mmol/L的CaCl2
              密度脂蛋白胆固醇（low⁃density lipoprotein⁃cholesterol，     溶液，以 1 000 r/min 运行 1 min 后加入终浓度为
              LDL⁃C）检测试剂盒（货号：A111⁃1⁃1、A110⁃1⁃1、                 0.05 U/mL的凝血酶，记录血小板聚集情况，5 min后
              F003⁃1⁃1、A113⁃1⁃1，南京建成生物工程研究所）。                   停止记录，采用比浊法测定血小板聚集率                   ［15，17］ 。
              FACSCalibur 流式细胞仪（BD Biosciences 公司，美             1.2.5  血小板表面CD62P表达的检测
              国），血小板聚集仪（北京泰利康信生物科技有限                                 用台氏液调整纯化血小板密度至5×10 个/mL，
                                                                                                       6
              公司）。                                              分别加入 1 μg PE 标记的 CD62P 抗体，室温下避光

              1.2  方法                                           孵育20 min后，依次加入终浓度为1 mmol/L的CaCl2
              1.2.1 动物饲养和分组                                     溶液和 0.05 U/mL 的凝血酶激活血小板 2 min，最后
                  40只雄性健康C57BL/6J小鼠（6周龄）购自昆明                    用1%的多聚甲醛固定，1 h内用FACSCalibur流式细
              楚商科技有限公司，所有小鼠均饲养在大理大学                             胞仪检测血小板表面 CD62P 的表达，并使用 FlowJo
              SPF 级动物房里（实验动物使用许可证号：SYXK                        （version 10.8.1）进行数据分析。探讨 CD36 信号通
             ［滇］2018⁃0002），环境温度22~24 ℃，提供适当的昼                   路在PNS 调控小鼠血小板高反应性的作用时，分离
              夜光变化周期（12 h光照/12 h黑暗交替），小鼠可自                      LFD 组和 LFD+PNS 组小鼠的纯化血小板以及 LFD
              由进食和饮水。经 2 周适应性喂养后，所有小鼠随                          组和 HFD 组小鼠血浆，在有或无 CD36 分子的中和
              机分为 4 组（10 只/组），即低脂饲料（low⁃fat diet，               性抗体FA6⁃152（1 μg/mL）的条件下，将LFD组小鼠
              LFD，含 10 kcal%脂肪）喂饲组（LFD 组）、LFD+PNS               或HFD 组小鼠血浆分别与LFD 组和LFD+PNS 组小
              组（饲料中添加 200 mg/kg 的 PNS）、高脂饲料（high⁃               鼠纯化血小板共同孵育 20 min，然后经血小板生理
              fat diet，HFD，含 45 kcal%脂肪）喂饲组（HFD 组）、             性激动剂ADP（5 μmol/L）刺激2 min 后用1%的多聚
              HFD+PNS 组（饲料中添加 PNS 200 mg/kg），PNS 的              甲醛固定，最后用流式细胞仪检测血小板表面
              剂量参考文献［14］。PNS粉末均匀混入LFD或HFD                       CD62P的表达水平       ［15，18］ 。
              中，动物饲料制作由江苏美迪森生物医药有限公司                            1.2.6  血小板分泌的PF4和CCL5水平检测
              完成。动物饲养过程中，每天查看小鼠的一般情况                                 在小鼠纯化血小板（1×10 个/mL）悬液中依次
                                                                                            8
              和摄食量，每周称体重，实验干预周期为 12 周。本                         加入终浓度为 1 mmol/L 的 CaCl2 和 0.1 U/mL 的凝
              研究已通过大理大学动物伦理委员会批准。                               血酶，激活 5 min 后，放于冰上终止反应，4℃离心
              1.2.2  小鼠纯化血小板的制备                                （1 000g，15 min），收集上清备用，上清中 PF4 和
                  小鼠纯化血小板的制备采用本实验室方法进                           CCL5 浓度的检测采用商业化的酶联免疫吸附试剂
                                                                                                       ［16］
              行 ［15-16］ 。实验干预的第12周末，小鼠禁食不禁水8 h                  盒进行测定，具体检测方法参照已发表文献 。
              后，腹腔注射 10%的水合氯醛（0.02 mL/g 体重）麻                    1.2.7  实时荧光定量 PCR 检测血小板 CD36 mRNA
              醉小鼠，通过心脏采血将小鼠全血注入含 3.8%枸                          表达水平

              橼酸葡萄糖抗凝剂的离心管中，室温静置 15 min                              将 PRP 离心（500 g，3 min）得到血小板沉淀后，
              后，离心（300g，2 min），收集上清得到富血小板血                      血小板总 RNA 的提取采用 mirVana miRNA 分离
                                                                                                 TM
              浆（platelet ⁃ rich plasma，PRP），将 PRP 进一步离心         试剂盒进行，最后取 1 μg 的 RNA 进行逆转录合成
             （500 g，3 min）以沉淀血小板，收集上清得到小鼠血                      cDNA，将 cDNA 进一步进行实时荧光定量 PCR 扩
              浆，将其冻存于-80 ℃用于后续血浆中血脂水平的                          增操作，mRNA相对表达量用2            -ΔΔCT 方法计算，GAPDH
              检测，血小板沉淀则用台氏液轻轻重悬得到纯化血                            管家基因当作内参 。所用引物序列见表1。
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