Page 10 - 《南京医科大学学报》2026年第1期
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第46卷第1期
               · 4  ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年1月


              量分析。                                              中免疫细胞的浸润水平，探究 THBS2 在 COAD 中的
              1.2.9  免疫组织化学染色                                   表达水平和各类免疫细胞浸润的相关性。
                  临床 CRC 癌组织与癌旁组织来自南京医科大                        1.3  统计学方法
              学附属第一医院，伦理批号为（2016）640。将人群样                            采用 Graph Prism 9.0 进行统计分析。所有数
              本组织在4%多聚甲醛中固定后制成组织切片，37 ℃                         据均以均值±标准差（x ± s）表示。两组间比较采
              烘箱烘片过夜，行常规脱蜡水化抗原修复，随后用                            用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，并用
              3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性15 min，10%羊                    Tukey 检验进行组间差异比较。P < 0.05 为差异有

              血清室温封闭 1 h，滴加 THBS2 抗体（1∶1 000）4 ℃                统计学意义。
              过夜。次日复温并清洗后，使用 Polymer⁃HRP 羊抗
                                                                2 结     果
              兔二抗试剂盒孵育 30 min，DAB 显色 5 min，再充分
              清洗、复染、脱水、透明、封片。正置显微镜随机采                           2.1  THBS2表达与CRC进展相关
              集 5 个 200 倍镜视野，使用 Image Plus Pro 软件进行                  为系统评估THBS2在CRC中的临床价值，本研
              分析，计算H⁃Score。                                     究基于TCGA数据库的转录组数据进行生物信息学

              1.2.10  多重免疫组化染色                                  分析。结果显示，COAD 肿瘤组织中 THBS2 mRNA
                  将临床组织切片行脱蜡水化与抗原修复后，用                          表达水平较正常结肠组织显著上调（P < 0.001，图1A）。
              3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性15 min，10%羊                    对 50 对配对的临床样本组织进行免疫组织化学检
              血清室温封闭 1 h，再滴加 FAP 抗体（1∶1 000）过                   测发现，THBS2在CRC癌组织中的表达强度较癌旁
              夜。次日复温并清洗后，使用 Polymer⁃HRP 羊抗兔                     组织增加 1.73 倍（P < 0.001，图 1B）。TCGA 的进一
              二抗试剂盒孵育 30 min 后，再滴加 TSA⁃690 荧光染                  步深度分析发现：THBS2高表达组患者中位OS较对
              料避光孵育 10 min，PBS 清洗后，将切片进行抗原                      照组缩短 43 个月（P < 0.001，图 1C）；在肿瘤进展分
              修复，重复上述实验步骤，依次孵育 THBS2 抗体                         析中，晚期（Ⅲ/Ⅳ期）COAD患者THBS2表达量较早
             （1∶1 000），TSA⁃570 荧光染料。采用 DAPI 复染细                 期（Ⅰ/Ⅱ期）升高 1.21 倍（P < 0.05，图 1D）；临床病
              胞核后封片，委托艾方生物公司进行全景荧光扫片                            理参数关联性分析表明，THBS2高表达与更晚期的
              用于后续分析。                                           T 分期（P < 0.05，图 1E）、淋巴结转移（P < 0.05，图
              1.2.11  癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，           1F）及远处转移倾向（P=0.058，图1G）显著相关。上
              TCGA）数据库分析                                        述证据提示，THBS2在CRC组织中呈现特异性高表
                  从TCGA数据平台（https：//cancergenome.nih.gov）       达特征，其表达水平与肿瘤恶性进展及不良预后密
              获取结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）肿瘤组              切关联，可能是评估CRC生物学行为的潜在分子标
              织和正常结肠组织的转录组表达谱及相应临床数                             志物。
              据，数据获取时间为 2025 年 2 月，包含 39 例正常                    2.2  CAF来源的THBS2表达与M2型巨噬细胞浸润
              组织、448 例原发肿瘤组织，用于分析 THBS2 在                       密切相关
              COAD 组织与正常组织中的表达差异。此外，通                                为明确 THBS2 的细胞来源，本研究首先整合
              过 Kaplan⁃Meier 生存分析评估 THBS2 表达水平与                 单细胞转录组分析及实验验证策略。基于 TISCH2
              COAD患者总生存期（overall survival，OS）的相关性。              单细胞数据库对 GSE166555 数据集的分析显示，

              1.2.12  TISCH2数据库分析                               THBS2 阳性细胞在成纤维细胞亚群中特异性富集
                  通过TISCH2数据库（http：//TISCH.comp⁃genomics.      （P < 0.05，图 2A）。TIMER2.0 数据库的免疫浸润分
              org）获取 CRC 单细胞数据集 GSE166555 进行分析，                 析进一步发现，THBS2 mRNA 表达水平与CAF 呈强
              基于 UMAP 降维可视化结果，通过 t⁃SNE 热图展示                     正相关（r=0.931，P < 0.001，图2B），提示THBS2可能
              细胞亚群的聚类分布，并分析基因THBS2在不同细                          主要来源于 CAF。CRC 组织多重免疫荧光染色结
              胞亚群中聚类表达。                                         果证实，THBS2 阳性细胞与 FAP CAF 共定位（图
                                                                                               +
              1.2.13  TIMER2.0数据库分析                             2C），从蛋白水平支持上述结论。
                  使 用 TIMER2.0 数 据 库（http：//timer.cistrome.          为验证CAF具有分泌THBS2功能，从CRC患者
              org/）反卷积算法进行分析，对 TCGA 等公共数据库                      新鲜组织中分离原代CAF及NF。Western blot结果显
              的批量RNA测序数据进行计算建模，量化肿瘤组织                           示，相比NF，CAF中α⁃SMA和FAP蛋白表达分别上调
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