Page 9 - 《南京医科大学学报》2026年第1期
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第46卷第1期          徐 甲，厉梦琪，袁小琴. 肿瘤相关成纤维细胞分泌THBS2通过PI3K/AKT通路驱动巨噬
                  2026年1月         细胞M2极化促进结直肠癌进展［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（1）：1-13                    · 3  ·


                DMEM 培养基中培养。所有细胞均置于 37 ℃、5%                       达水平，引物序列见表1。
                CO2的加湿培养箱中培养。                                                    表1   PCR引物序列
                1.2.2  细胞转染                                                Table 1 Sequences of PCR primers
                    根据 LipoGene 2000 转染试剂说明书，将含有                    Gene              Primer sequence（5’→3’）
                                 TM
                THBS2的siRNA加入LipoGene 2000转染溶液中制                   β⁃actin     Forward：TCATGAAGTGTGACGTGGACAT
                                           TM
                备 siRNA⁃脂质体复合物，室温孵育 20 min，然后将                                 Reverse：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG
                siRNA⁃脂质体复合物加入 CAF 细胞中，37 ℃培养                      IL⁃1β       Forward：AGCTACGAATCTCCGACCAC
                6 h后，更换为DMEM完全培养基，继续培养48 h。                                    Reverse：CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA

                1.2.3  条件培养基的收取                                    IL⁃6        Forward：GGACAACTCAGGGATGCAAT
                                                                               Reverse：GCAGAAGAGAGCCAACCAAC
                    将 NF 和 CAF 细胞以 3×10 个/孔的浓度接种在
                                           5
                                                                   TNF⁃α       Forward：CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG
                6 孔板中。6~8 h 后，更换为含有 4%胎牛血清的
                                                                               Reverse：GAGGACCTGGGAGTAGATGAG
                DMEM培养基，并于24 h后收集细胞上清；收集转染
                                                                   IL⁃10       Forward：AAGCCTGACCACGCTTTCTA
                了THBS2⁃siRNA 48 h后的CAF细胞上清。所有上清                                Reverse：ATGAAGTGGTTGGGGAATGA
                均用0.22 μm滤器过滤，分装后于-80 ℃冰箱保存。                       CD206       Forward：TGACGAATTGTGGATCGGCT
                1.2.4  巨噬细胞极化诱导实验                                              Reverse：CCAGTACCCATCCTTGCCTT
                    THP⁃1细胞以5×10 个/孔的浓度接种在24孔板                     ARG1        Forward：TGGACAGACTAGGAATTGGCA
                                     5
                中，加入100 ng/mL PMA 诱导24 h，使THP⁃1细胞分                             Reverse：CCAGTCCGTCAACATCAAAACT
                                                                   THBS2       Forward：CCGCCTACCGTTTTGTACG
                化为贴壁巨噬细胞，按照以下分组进行相关刺激。
                                                                               Reverse：CTGGGCCATTGGACACAATCT
                单一刺激因子组：LPS 组（100 ng/mL LPS）、IL⁃4 组
               （20 ng/mL IL⁃4）。条件培养基处理组：NF上清诱导                    1.2.7  ELISA实验
                组（NF⁃CM），将NF上清与RPMI 1640完全培养基以                        收取CAF与NF培养基上清，700 g离心5 min去
                1∶1 混合；CAF 上清诱导组（CAF⁃CM）：将 CAF 上清                 除杂质及细胞碎片，按照人THBS2 ELISA 试剂盒说
                与RPMI 1640完全培养基以1∶1混合。组合刺激组：                      明，检测 THBS2 的水平。首先，将 100 μL 捕获抗体
                THBS2+IL⁃4 组（100 ng/mL THBS2+20 ng/mL IL⁃4）；      加入 96 孔板中，4 ℃包被过夜，弃去液体，洗涤液清
                THBS2 + LPS 组（100 ng/mL THBS2 + 100 ng/mL         洗 3 次。随后将梯度稀释的标准品和待测样本在
                LPS）。敲低处理组：si⁃2⁃CM组，THBS2敲低CAF上                   37 ℃孵育 1 h。洗涤后每孔加入 50 μL 生物素标记
                清1∶1混合RPMI 1640培养基；si⁃3⁃CM组：THBS2敲                的检测抗体，室温避光孵育2 h洗涤后，加入100 μL
                低 CAF 上清 1∶1 混合 RPMI 1640 培养基；si⁃nc⁃CM            链霉亲和素⁃HRP工作液，室温避光孵育1 h。加入显
                组：对照 CAF 上清 1∶1 混合 RPMI 1640 培养基。所                色液，室温避光孵育30 min后，用50 μL终止液终止
                有分组细胞均在相应处理条件下继续培养24 h。                           反应，使用酶标仪在450 nm处测定样品吸光度。最
                1.2.5  巨噬细胞迁移实验                                   后，绘制标准曲线并计算待测样品中THBS2的含量。
                    将 2×10 个 PMA 刺激后的 THP⁃1 细胞接种于                 1.2.8  Western blot检测
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                Transwell 上室，并使用不同条件培养基（NF⁃CM、                        使用配制好的蛋白裂解液（RIPA∶PI∶PMSF=100∶
                CAF⁃CM）处理，同 1.2.4 节；对照组（PBS）及 THBS2               1∶1）裂解细胞沉淀，冰上静置30 min后13 000 r/min
                组（100 ng/mL THBS2）、THBS2 敲 低 CAF 上 清 组            4 ℃离心 15 min，提取蛋白上清并用 BCA 法进行定
               （si⁃2⁃CM、si⁃3⁃CM）和对照CAF上清组（si⁃nc⁃CM）处              量，100 ℃金属浴5 min，使蛋白变性后置于-80 ℃保
                理同 1.2.4 节，对下室进行处理，36 h 后取出小室进                    存。将等量蛋白样本在 10%SDS⁃PAGE 中电泳，然
                行固定染色，清洗拍照。                                       后将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶在室温封闭

                1.2.6  qRT⁃PCR实验                                  1 h，加入PI3K抗体、p⁃PI3K抗体、Akt抗体、p⁃Akt抗
                    分别收集各组细胞，Trizol 法提取总 RNA，并按                   体、THBS2抗体、α⁃SMA抗体、FAP抗体、Vimentin抗

                试剂盒说明书逆转为 cDNA。随后用 SYBR Green                     体、GAPDH抗体、β⁃actin抗体，4 ℃孵育过夜。TBST
                Mix 试剂配制 qRT⁃PCR 反应体系，在实时荧光定量                     洗涤后，加入相应特异性二抗（1∶10 000），摇床室温

                PCR仪上设定反应程序并进行PCR检测。以β⁃actin                      反应1 h。洗膜后，滴加ECL化学发光液于暗室中显
                                 -ΔΔCT 法计算各靶基因的mRNA表              影、曝光。使用 Image J 软件（Version 1.5.3）进行定
                为内参基因，采用2
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