Page 64 - 南京医科大学自然版
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第46卷第10期
               ·1494 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年10月


                              表1 siRNA序列                        入5 μL Annexxin V⁃FITC和5 μL PI，混匀，室温避光
                          Table 1 Sequences of siRNA            孵育10~20 min，1 h内上机检测。

               Gene name         Primer sequence（5′→3′）              检测细胞周期：Jurkat细胞用1 mL PBS重悬，缓
               si⁃ZNF326  Sense：GGUAGUUAUGGUGGUCGAUUUTT         慢加入预冷的100%乙醇，吹打混匀，4 ℃固定过夜，
                         Antisense：AAAUCGACCACCAUAACUACCTT
                                                                1 000 g离心5 min，PBS清洗2次再次离心，加50 μL
               si⁃NC     Sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
                                                                RNase A 和 450 μL PI 的染色液 500 μL，重悬，37 ℃
                         Antisense：ACGUGACACGUUCGGAGAATT
                                                                孵育30~60 min，上机检测。
              入RIPA裂解液冰上裂解30 min，随后于4 ℃、12 000 g                1.2.7 转录组测序
              离心 15 min。吸取上清液测定蛋白浓度，随后进行                             收集经慢病毒感染处理后的 Jurkat 细胞（NC
              SDS⁃PAGE电泳并转膜，使用5%的脱脂奶粉溶液封                        组、ZNF326 过表达组），使用 TRIzol 提取总 RNA，分
              闭 PVDF 膜。分别孵育一抗（ZNF326、SERPINB2 及                 离mRNA 并片段化，合成双链cDNA，进行末端修复
              内参GAPDH抗体）与HRP标记的二抗，最后对膜进                         与文库构建，随后上机测序。通过生物信息学对原
              行显影。                                              始数据进行质控、基因表达定量及差异基因分析。

              1.2.4  实时荧光定量 PCR（RT⁃qPCR）检测 mRNA                 1.3  统计学方法
              表达                                                     使用 GraphPad Prism 8.2 进行统计分析及可视
                  采用 TRIzol 试剂提取 Jurkat 细胞总 RNA，经琼              化。所有数据均录入SPSS26.0统计软件进行分析，
              脂糖凝胶电泳验证RNA完整性后，按照逆转录试剂                           数据以均值±标准差（x ± s）表示。多组间的比较使
              盒说明书将总 RNA 逆转录为 cDNA。以 cDNA 为模                    用单因素方差分析和双因素方差分析，其中，双因
              板，采用2×RealStarPower SYBR qPCRMix，进行荧光             素方差分析的两个因素分别为分组因素和时间因
              定量PCR检测，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃                    素。所有实验均独立重复3次，P < 0.05为差异有统
              变性 10 s，60 ℃退火延伸 30 s，共 40 个循环。以                  计学意义。
                                          - ΔΔCT
              GAPDH 作为内参基因，采用 2               法计算 ZNF326
                                                                2  结 果
              mRNA 的相对表达量，所有实验独立重复 3 次以保
              证结果可靠性。各基因引物如表2所示。                                2.1  ZNF326在ALL细胞中高表达
                                                                     正 常 组 织 数 据 均 来 源 于 Genotype⁃Tissue
                           表2 RT⁃qPCR引物序列                       Expression database，ALL 患者外周血淋巴细胞数据
                     Table 2 Sequences of RT⁃qPCR primers
                                                                来自 TARGET 数据库。ZNF326 在 TARGET 数据库
               Gene name          Primer sequence（5′→3′）        的 ALL 总体样本（未按亚型细分）中表达异常。通
               ZNF326      Forward：TGCTGCTCTTGGGAGTGAAT
                                                                过 mRNA 表达差异散点图显示，与正常组织相比，
                           Reverse：GGAAACATGGTCACAAAGAGCC
                                                                ZNF326 在 ALL 患者外周血淋巴细胞中高表达（P <
               SERPINB2    Forward：TCAGAACCCCAGGCAGTAGA
                                                                0.001，图 1）。基因表达差异散点图展示 ZNF326 在
                           Reverse：GACAGCATTCACCAGGACCA
                                                                肿瘤组织与正常组织中的表达差异，肿瘤组织中
               GAPDH       Forward：TCCAAAATCAAGTGGGGCGA
                                                                ZNF326表达显著升高（P < 0.001）。
                           Reverse：AAATGAGCCCCAGCCTTCTC
                                                                2.2  敲低ZNF326抑制T⁃ALL细胞的增殖
              1.2.5 CCK⁃8法检测细胞活力                                     RT⁃qPCR结果显示，与si⁃NC组相比，si⁃ZNF326
                                              3
                  将转染后的Jurkat 细胞以5×10 个/孔接种于96                  组细胞中 ZNF326 的 mRNA 表达水平显著降低（P <
              孔板，每组设 6 个复孔。分别于培养 0、24、48、72 h                   0.001，图2A）；Western blot结果进一步证实，敲低组
              时，每孔加入10 μL CCK⁃8试剂，37 ℃孵育1 h后，使                  ZNF326 蛋白表达水平明显低于 NC 组（图 2B）。上
              用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。最后以对照                         述结果表明 siRNA 具有良好的干扰效果，可用于后
              组对实验组进行归一化处理，计算细胞增殖速率。                            续实验；CCK⁃8结果显示，相比NC组，敲低组细胞增
              1.2.6 流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡                          殖速度下降（P < 0.000 1，图 2C），结果表明，敲低
                  收集2份经siRNA转染处理后的Jurkat细胞。                     ZNF326可显著抑制T⁃ALL细胞的增殖能力。
                  检测细胞凋亡：收集细胞离心弃上清，PBS洗涤                        2.3 过表达ZNF326促进T⁃ALL细胞的增殖
              细胞，加入 500 μL Binding Buffer（1×）重悬细胞，加                  荧光显微镜下观测到LV⁃NC组和LV⁃ZNF326组
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