Page 48 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期
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第46卷第2期
               ·204 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年2月


              激酶2（cyclin⁃dependent kinase 2，CDK2）、信号转导和         的细胞。
              转录激活因子3（signal transducer and activator of tran⁃  1.2.4 HE染色
              scription 3，STAT3）抗体（Proteintech 公司，美国）；               4%多聚甲醛灌注固定小鼠大脑，经蔗糖梯度脱
              Dixdc1 抗体（Santa Cruz 公司，美国）；胶质纤维酸性                水后进行OCT包埋并沿冠状面将脑组织切成10 μm
              蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、增殖细      的切片，贴于载玻片上。依次经过以下染料完成
              胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、    HE染色：苏木素染液10 min，自来水冲洗，分化液分
              p⁃STAT3抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）；        化 30 s，伊红染液 1 min，依次浸入 70%、80%、90%、
              Cyclin A 抗体（Abcam 公司，英国）；DMEM 培养基                 100%乙醇进行脱水，二甲苯透明并用中性树胶封片
             （Gibco 公司，美国）；胎牛血清（上海 LONSERA 公                    后显微镜下观察。

              司）；DMEM/F12 培养基、胎牛血清、脂多糖、TRIzol                   1.2.5 免疫组织化学染色
             （Sigma 公司，美国）；质粒抽提试剂（Omega BioTek，                      根据 DAB 检测试剂说明书对脑组织切片进行
              美国）；逆转录试剂（Takara Bio 公司，日本）；DAB 检                 免疫组织化学染色。冰冻切片 37 ℃烘箱中烘烤
              测试剂（上海 Genetech 公司）；PI/RNase 染色缓冲液                1 h，PBS 洗涤后用内源性过氧化物酶阻断剂在室

             （BD Biosciences 公司，美国）；SYBR Green qPCR Mix         温下孵育 2 h，然后用 Dixdc1 抗体（1∶50）和 GFAP
             （2×）、EdU⁃555 细胞增殖检测试剂盒、青霉素⁃链霉                      抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜。次日切片经 PBS 洗涤
              素（上海碧云天生物技术公司）；4%多聚甲醛（合肥                          后用二抗室温孵育 2 h，DAB 显色，脱水后中性树
              Biosharp 公司）；PVDF 膜（Millipore 公司，美国）。             脂封片，显微镜下观察并拍摄。
              Dixdc1 敲低慢病毒载体的构建与包装由青岛蔚蓝                         1.2.6 组织免疫荧光染色
              生物科技股份有限公司完成。                                          冰冻切片使用 PBS 漂洗后，封闭液（PBS+10%
              1.2  方法                                           FBS+ 0.3% TritonX⁃100）室温下封闭 2 h，接着用一
              1.2.1 构建小鼠TBI模型                                   抗稀释液（PBS+1% FBS+0.3% TritonX⁃100）稀释抗
                  使用受控皮质撞击装置（controlled cortical im⁃            体，Dixdc1 抗体（1∶50）和 GFAP 抗体（1∶200）于 4 ℃
              pact，CCI）诱导 TBI 模型   ［15］ 。分离肌肉及骨膜暴露              孵育16 h，PBS漂洗后加入相应的荧光二抗，室温孵
              颅骨后，于冠状缝和人字缝之间，中线旁 2 mm 处                         育 2 h，PBS 漂洗后 Hoechest 染色 10 min。用封片剂
              进行开窗（直径约4 mm），移除骨瓣暴露脑组织，连接                        封固后显微镜下观察。
              冲击装置，并设置参数（活塞速度4.0 m/s，变形深度                       1.2.7 细胞免疫荧光染色
              为2.0 mm，停留时间200 ms），使撞击杆尖端垂直于                          细胞以适量密度铺在24孔板上，在不同实验处理
              硬脑膜，给予小鼠 1 次中重度皮质撞击。除不进行                          后弃去培养基，PBS洗涤后用甲醇4 ℃固定15 min。封
              CCI损伤外，假手术组小鼠接受相同的手术。                             闭液室温封闭2 h后，用一抗稀释液稀释抗体，加C3
              1.2.2 细胞培养与刺激                                     抗体（1∶50）和 S100A10 抗体（1∶50）于 4 ℃孵育
                  小鼠 C8⁃D1A 细胞用完全培养基（DMEM 基础                    16 h，PBS 洗涤后加入相应的荧光二抗，室温孵育
              培养基、10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素），小鼠原                        2 h，PBS 洗涤后 Hoechest 染色 10 min。用封片剂封
              代星形胶质细胞用完全培养基（DMEM/F12、10%胎                       固后显微镜下观察。
              牛血清、1%青霉素⁃链霉素），37 ℃水浴复苏后接种于                       1.2.8 Western blot检测
              细胞培养皿中，置于37 ℃恒温培养箱（含5% CO2）。                           使用RIPA裂解液充分裂解组织、细胞后，4 ℃高
              当细胞生长到合适密度时，分别用 1 μg/mL LPS 刺                     速离心20 min后留取上清于EP管中。BCA蛋白检测
              激 C8⁃D1A 细胞   ［16］ 、100 ng/mL LPS 刺激小鼠原代星         试剂测量蛋白样品浓度。7.5%或12.5% SDS⁃PAGE
                        ［17］
              形胶质细胞 。                                           分离蛋白样品（每孔20 μg蛋白），并转移到PVDF膜
              1.2.3 星形胶质细胞慢病毒感染实验                               上。5%脱脂牛奶常温下封闭2 h。TBST洗涤后一抗
                  星形胶质细胞以适量密度接种到培养皿中后，将                         4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入相应二抗，室温孵育
              慢病毒悬液40 μL加入到2 mL细胞培养基中，混匀并                       2 h。将处理后的PVDF膜置于化学发光成像系统中
              加入细胞后放回恒温培养箱中孵育。24 h后更换新                          采集特异性信号。
              鲜的完全培养液继续培养。72 h后荧光显微镜观察                          1.2.9 Real⁃time PCR实验
              病毒感染效率，加入适当浓度嘌呤霉素筛选稳定转染                                使用 TRIzol 试剂提取细胞中的总 RNA，并使用
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