Page 49 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期

第46卷第2期 汤莉巧，段程伟，陈伟观，等. 下调Dixdc1表达抑制创伤性脑损伤后星形胶质细胞极化［J］.
2026年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（2）：202-212 ·205 ·

逆转录试剂将RNA逆转录成cDNA。实时荧光定量 间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因
PCR仪扩增目的基因，以β⁃Actin为内参。将得到的 素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
Ct 值按照 2 -ΔΔCt 进行计算。引物由南京擎科生物科
2 结 果
技公司合成，引物序列见表1。
2.1 Dixdc1蛋白在TBI后皮质中表达上调
表1 Real⁃time PCR引物序列
首先对小鼠TBI后不同时间的脑组织切片进行
Table 1 Primer sequences used in real⁃time PCR
Gene Primer sequence（5′→3′） HE染色，结果显示小鼠大脑右半球损伤，并随着损
伤时间的延长，损伤部位的脑组织结构缺失，血肿
Serping1 Forward：AACTTGGACCAGGACGCAG
Reverse：GAGAAGGCTCTATCCCCAGC 逐渐被吸收，神经细胞水肿坏死并伴有炎症细胞浸
H2.D1 Forward：AAGACCTGAAAACGTGGACGG 润（图 1A）。先前研究表明 Dixdc1 能够促进 TBI 后
Reverse：TAATGCTCTGCAGCACCACTCT 星形胶质细胞增殖 ［14］ 。据此，通过Western blot检测
Gbp2 Forward：AGCTGCACTATGTGACGGAG
TBI 后 Dixdc1 蛋白的表达，结果显示与 Sham 组相
Reverse：AGCCCACAAAGTTAGCGGAA
比，损伤后Dixdc1的蛋白表达增加，且于损伤3 h后
Srgn Forward：TGTTCAGGAACCCAACTCGC
达峰值（图1B、C）；GFAP的蛋白表达在损伤后1、3 d
Reverse：GTCACATAGCCACGGTAGGAG
明显增加（图 1B、D）。对 Sham 组及 TBI 3 h 组小鼠
S100A10 Forward：TCTTCGGCACTAGCCTCATC
的脑组织切片进行免疫组织化学染色，与Sham组相
Reverse：AAGAGTCTGTCGAAACCTGGG
比，Dixdc1 在损伤周围脑皮质区域的阳性信号增加
Clcf1 Forward：CCTCCGAGCAGGGGACT
Reverse：TGTGCGATTAAGAGCTGGCA （图1E、F），损伤周围脑皮质区星形胶质细胞存在明
Emp1 Forward：CCCTCACTGTGGTTGCAAATC 显活化（图1G、H）。提示Dixdc1在小鼠脑损伤皮质
Reverse：GAGAATTCTGGAGTATCCAGTGAGA 中的表达增加且星形胶质细胞明显活化。
β⁃Actin Forward：TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA
2.2 Dixdc1蛋白与星形胶质细胞存在共定位
Reverse：TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC
为进一步探索 Dixdc1 蛋白在 TBI 后的定位变
1.2.10 细胞划痕实验 化，使用双免疫荧光抗体对 Sham 组及 TBI 3 h 组的
采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。将细 小鼠脑组织切片进行染色。与Sham组相比，TBI后
胞接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，用10 μL枪 Dixdc1、GFAP阳性信号均增加，且Dixdc1与GFAP的
头在6孔板内画3条竖线，用PBS洗去划痕处多余的 阳性信号存在共定位（图2A、B），表明Dixdc1可能是
细胞，显微镜下观察拍摄，无血清细胞培养基继续 参与TBI后星形胶质细胞活化的潜在分子。除星形
培养24 h后，采集细胞迁移的图片。 胶质细胞外，检测发现Dixdc1与小胶质细胞标志物
1.2.11 EdU细胞增殖检测 Iba1、神经元标志物 NeuN 阳性信号不存在交叉（图
使用 EdU 细胞增殖试剂盒检测细胞增殖。将 2C、D）。提示Dixdc1在星形胶质细胞中特异性表达，
细胞接种于6孔板中，细胞经过实验处理后，将细胞 因此选择星形胶质细胞这一细胞类型进行后续实验。
与含 10 μmol/L EdU 的培养基一起孵育 2 h 后，用 2.3 LPS刺激促进星形胶质细胞中Dixdc1蛋白表达
Azide 555溶液（红色）和Hoechst（蓝色）对细胞进行 使用LPS刺激C8⁃D1A细胞来构建体外星形胶质
染色。在荧光显微镜下观察。 细胞活化模型 ［16］ 。Western blot 检测显示，1 μg/mL
1.2.12 细胞周期检测 LPS刺激星形胶质细胞后Dixdc1、GFAP、PCNA的蛋
细胞消化后收集于 15 mL 离心管中，离心弃上 白表达增加（图3），且于刺激后24 h Dixdc1和GFAP
清后用 PBS 清洗细胞沉淀，再次离心弃上清液后用 蛋白表达增加最为明显，因此选择 1 μg/mL LPS 刺
75%乙醇固定细胞过夜。固定结束后，离心弃上清 激细胞 24 h 进行后续实验。值得注意的是，LPS 刺
液并用 PBS 清洗残余的乙醇。在细胞沉淀中加入 激后Dixdc1表达变化趋势与GFAP表达变化具有一
500 μL PI染色液重悬，室温避光孵育15 min后使用 致性，因此推测Dixdc1对星形胶质细胞活化具有调
流式细胞分析仪分析。 控作用。

1.3 统计学方法 2.4 敲低 Dixdc1 抑制 LPS 诱导的星形胶质细胞增
所有量化数据均通过GraphPad Prism进行统计 殖和迁移
分析。计量数据以均数±标准差（x ± s）表示。两组 为了探究 Dixdc1 是否调控星形胶质细胞的增