Page 9 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2026年第3期
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第46卷第3期 刘志洁，陶子琦，黄 希，等. 脂质摄取在卵巢癌微环境中诱导CD4+调节性T细胞表达PD⁃1和CTLA⁃4
2026年3月 的作用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（3）：315-323 ·317 ·
司，美国），电热恒温孵育箱（上海精宏实验设备有 胞的TSN共培养72 h，1 mL BODIPY 493/503⁃FITC
TM
限公司）。油红 O 染液（北京索莱宝公司），Ficoll 淋 染料37 ℃孵育15 min，流式检测CD4 Treg的脂质含
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巴细胞分离液（天津灏洋公司），透明质酸粉末、Ⅳ 量；CD4 Treg与50%CAOV3细胞的TSN共培养 72 h
型胶原酶、DNA 酶Ⅰ（Sigma 公司，美国），L⁃谷氨酰 后，再与不同浓度（2、5、10 μmol/L）的脂肪酸类似
TM
胺（Gibco公司，美国），BODIPY™ 493/503、BODIPY TM 物 BODIPY 500/510 C1 C12 孵育 15 min，流式检测
500/510 C1C12（ThermoFisher Scientific 公司，美国）； CD4 Treg内的脂质含量。
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PE/Cyanine7 标记人 CD45 抗体、Horizon BV510 标 1.2.4 抑制剂Etomoxir、C75或SSO处理后CD4 Treg
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TM
记人 CD3 抗体、APC 标记人 CD4 抗体、PE 标记人 的脂质含量及PD⁃1、CTLA⁃4表达水平检测
Foxp3 抗体、BV421 标记人 CCR8 抗体、APC 标记人 CD4 Treg经Etomoxir、C75、SSO或DMSO处理2 h
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CD279（PD ⁃ 1）抗 体 、PE/Cyanine7 标 记 人 CD152 后，离心弃上清，再将其与 50%的 CAOV3 细胞 TSN
（CTLA⁃4）抗体（Biolegend 公司，美国）；脂肪酸氧化 共培养 72 h 后，收集 CD4 Treg，加入 1 mL BODIPY TM
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（fatty acid oxidation，FAO）抑制剂（Etomoxir）、脂肪 493/503⁃FITC染料37 ℃孵育15 min，洗涤后重悬。加
酸合成抑制剂（C75）和脂肪酸摄取抑制剂磺基⁃N⁃ 入APC标记人CD279（PD⁃1）抗体、PE/Cyanine7 标记
琥 珀酰亚胺油酸酯（sulfo⁃N⁃succinimidyl oleateo， 人CD152（CTLA⁃4）抗体（稀释度均为1∶50）各2 μL，
SSO）（MCE 公司，美国）；CD4 Treg 分离试剂盒、 4 ℃避光孵育 30 min，流式检测 CD4 Treg 的 PD⁃1、
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CD4 CD25 Treg 分离试剂盒（Miltenyi Biotec 公司， CTLA⁃4的表达水平和脂质含量。
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德国）。 1.3 统计学方法
1.2 方法 采用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行分
1.2.1 组织样本流式检测 析。两组间计量资料的比较用独立样本 t 检验；多
将新鲜的OV患者术后标本，剪成1 mm 左右的 组间的数据比较用单因素方差分析。P < 0.05为差
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小块，在配制的原代组织消化液（RPMI⁃1640 培养基、 异有统计学意义。
1 μg/mL 胶原酶Ⅳ、100 ng/mL 透明质酸酶、50 U/mL
2 结 果
DNA 酶 Ⅰ、1 mmol/L谷氨酰胺和1%青霉素⁃链霉素
溶液）中 37 ℃消化 1 h，将过滤后的细胞悬液使用 2.1 OV组织中浸润性CD4 Treg存在脂质含量和脂
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60% Percoll、40% Percoll梯度离心，得到单个核细胞 质摄取能力增强
悬液，加入 BODIPY™ 荧光染料 1 mL，37 ℃孵育 使用亲脂性荧光染料 BODIPY TM 493/503 检测
TM
15 min，加入 PE/Cyanine7 标记人 CD45 抗体、BV510 细胞内脂质含量，使用荧光脂肪酸探针 BODIPY
标记人 CD3 抗体、APC 标记人 CD4 及 PE 标记人 500/510 C1 C12 检测细胞脂质摄取。在 OV 组织中
Foxp3抗体（稀释度均为1∶50）各2 μL，4 ℃避光孵育 观察到 CD4 Treg 的脂质含量及脂质摄取能力相比
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30 min，流式检测CD4 Treg（CD45 CD3 CD4 Foxp3 ）、 CD4 Tconv 均增加，且差异有统计学意义（P 均<
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传统CD4 T细胞（conventional CD4 T cell，CD4 Tconv） 0.01，图 1）。
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（CD45 CD3 CD4 Foxp3）的胞内脂质。 2.2 脂质摄取有助于CD4 Treg在体外OV细胞TSN
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1.2.2 检测 CD4 Treg 与肿瘤细胞培养上清（tumor 中的脂质积累
supernatant，TSN）体外共培养后的脂质含量 从外周血中分离人CD4 Treg与OV细胞系（ES⁃2、
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收集处于对数生长期 OV 细胞的 TSN，0.45 μm SKOV3或CAOV3）或正常卵巢细胞（Hosepic）的培养
滤器过滤后现用。取健康志愿者外周血 50 mL，用 上清共同孵育。结果显示，暴露于OV细胞TSN中的
CD4 CD25 Treg 分离试剂盒，分选得到 CD4 Treg 细 CD4 Treg内脂质含量和脂质摄取相比对照组均升高，
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胞，以5×10 个免疫细胞加1 mL OV TSN的体系培养， 尤其在 CAOV3 组中明显（图 2）。这表明，OV 细胞
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于72 h后收集细胞，1 mL BODIPY 493/503⁃FITC染 TSN显著上调了CD4 Treg中的脂质含量。
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料37 ℃孵育15 min，流式检测CD4 Treg胞内的脂质 将 CD4 Treg 与不同浓度（10%、30%或 50%）的
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含量。 CAOV3 细胞 TSN 共培养，分析细胞内脂质含量；将
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1.2.3 检测 CD4 Treg 与 CAOV3 细胞的 TSN 体外共 CD4 Treg与50%浓度的CAOV3细胞TSN共培养后，
培养后的脂质摄取 用不同浓度（2、5、10 μmol/L）的荧光脂肪酸类似物
CD4 Treg 分别与 10%、30%、50%的 CAOV3 细 BODIPY 500/510 C1 C12 处理，以评估脂质摄取情
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