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第46卷第6期           汤依然，李 迎，厉廷有. 基于功能蛋白设计靶向多肽及小分子化合物：5个神经系统疾
                  2026年6月           病候选药物的设计策略［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（6）：927-934                  ·931  ·


                元氧化应激增加现象，调控 Keap1⁃Nrf2 通路抑制细                     针，采用荧光偏振法对小分子化合物库进行初筛，
                胞氧化应激可延缓疾病进程。生理状态下，核因子                            挑选了抑制率>12%的化合物，获得489个初筛化合
                相关因子 2（nuclear factor erythroid 2⁃like 2，Nrf2）与   物。随后结合量效曲线及表面等离子体共振技术
                Kelch 样 ECH 相关蛋白 1（Kelch⁃like ECH⁃associated      对初筛化合物进行二次验证，最终获得 8 个二级化
                protein 1，Keap1）结合，并靶向 E3 泛素化降解，在体                合 物 ，其 中 含 有 四 氢 异 喹 啉 的 小 分 子 化 合 物
                内维持低表达水平。而在疾病模型中，过量活性氧                            LH601A具有开发为新一代抑制剂的潜力                 ［31］ 。分子
                激活下游抗氧化应激元件，使Keap1构象改变，失去                         对接显示，LH601A 主要通过结构中的羧基基团与
                对Nrf2的抑制活性；Nrf2大量蓄积并转入细胞核，启                       Keap1的R415和R380形成盐桥。
                动抗氧化酶、解毒酶等多种保护性基因的转录，发                                通过分析 LH601A 对接结果可见，LH601A 未
                挥对有毒物质及氧化损伤的防御功能                 ［26-27］ 。        能完全占据由 L365、V604 等疏水残基围绕的口袋，
                    Keap1 的 Kelch 结构域是 1 个六叶片β螺旋桨，                该口袋内部含有 6 个结构保守的水分子，若与水分
                4 条β链通过不同长度的连接环相连，连接环长度差                          子形成氢键可显著提升化合物活性，对此研究人员
                异使其顶端形成浅口袋，作为 Nrf2 的结合位点。                         在四氢异喹啉 5 位引入羟基，其可直接与 L365、
                Nrf2 N 端 Neh2 结构域是与 Keap1 结合的核心区域，                V604 形成氢键；此外，参考肽类在该位点是由酰胺
                其中 DXETGE 序列高度保守。Chen 等           ［28］ 基于该序       与 Keap1 的 S363 和 N414 形成氢键，推测将羧基替
                列设计不同长度肽段并展开体外竞争结合实验，结                            换为酰胺可保留结合活性，同时增加血⁃脑屏障透
                果显示，肽段 AFFAQLQLDEETGEFL（16 肽）可有效                  过性。酰胺键搭配环丁烷可有效解决环己烷的空
                抑制 Keap1⁃Nrf2 的结合，其 Kd 值为 20 nmol/L，与完            间位阻问题，基于上述改造策略，最终获得化合物
                整 Nrf2 结合亲和力相当。X 线晶体衍射解析表明，                       23，X 线晶体衍射证实，化合物 23 可与 Keap1 的
                16 肽能形成稳定的β转角构象，该构象可模拟 Nrf2                       S363、N414、R415 形成 3 个氢键，IC50为 2.5 μmol/L，
                与 Keap 1 的相互作用，嵌入 Keap1 口袋         ［29］ 。16 肽β    并能透过血⁃脑屏障          ［32-33］ 。化合物 23 亲和力弱于
                转角上的E79、E82与Keap1的R415、R380等残基形                   16 肽，但其易通过膜扩散进入细胞，且极大地解决
                成氢键，且T80可形成分子内氢键来稳定构象 。                           了 16 肽只能注射给药的问题，为后续 Keap1⁃Nrf2
                                                        ［30］
                    鉴于目前缺乏靶向Keap1⁃Nrf2蛋白互作的直接                     相互作用抑制剂的研发提供了具有成药潜力的骨
                小分子抑制剂，研究团队用荧光标记肽段作为探                             架（图4）。



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                                                                   O O                           O O
                                                                                          O O   O O  NH
                                                               O O    O O  COOH                N N  NH22
                                                                        COOH
                                                                     N N                    O O
                                                                                              OH
                                                                                              OH
                N⁃terminal of Nrf2 and its binding  16⁃mer peptide and its binding  Binding mode of compound  Binding mode of compound
                     mode with Keap⁃1        mode with Keap⁃1        LH601A with Keap⁃1          23 with Keap⁃1
                                         图4 利用荧光偏振测定法进行筛选从16肽获得小分子23
                    Figure 4 Identification of small molecule 23 from the 16⁃mer peptide via fluorescence polarization assay screening

                    本案例通过截短优化确定最小活性肽段序
                                                                  5  利用死亡陷阱筛选技术获得 NH 多肽并筛选获
                列，并以该活性肽段为探针，采用均质荧光偏振法
                                                                  得小分子2
                对化合物库进行筛选，实现肽类化合物向小分子
                化合物的转化。该筛选策略适用于有已知受体⁃                                  阿尔兹海默病核心病理特征为β淀粉样蛋白
                配体结合体系但蛋白晶体尚未解析、无法开展虚                             沉积，神经元大量死亡。其中，淀粉样前体蛋白
                拟筛选的情况，其核心优势在于依托实验验证保                            （amyloid precursor protein，APP）V642I 突变是诱导
                障筛选特异性；但该方法存在筛选工作量大、通量                            神经元死亡的关键环节 。
                                                                                       ［34］
                受限的局限性，不适用于大规模化合物文库的初                                 Hashimoto等 ［35］ 构建了V642I⁃APP稳转细胞系，
                筛，更适用于二级筛选阶段的活性化合物验证与                             该细胞系可诱导细胞死亡。利用“死亡陷阱筛选”
                优化。                                              （death⁃trap screening）技术，通过转染候选 cDNA 文
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