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第41卷第1期
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                  宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，起源于                          AGAA⁃3′；GAPDH 上游 5′⁃AAGGCTGTGGGCAAGG⁃
              宫颈腺柱状上皮、鳞状上皮以及储备细胞，其恶性                            3′，下游5′⁃TGGAGGAGTGGGTGTCG⁃3′。
                                              ［1］
              程度较高，呈浸润生长且易发生转移 。已有大量研                           1.2  方法
              究表明肿瘤发生侵袭迁移与Wnt/β⁃catenin通路具有                     1.2.1 MTT细胞增殖实验
              重要关系，该通路异常直接影响肿瘤的转移 。                                  取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，计数后配
                                                         ［2］
              Wnt/β⁃catenin信号通路变化能够促进宫颈癌的发生                     制成 1.5×10 个/mL，以每孔 100 μL 加入 96 孔板中，
                                                                           5
              发展 ，β⁃catenin 作为转导途径的核心元件参与调                      37 ℃、饱和湿度、5% CO2细胞培养箱培养24 h后，分
                  ［3］
                      ［4］                         ［5］
              节该通路 ，从而促进宫颈癌的发生发展 。Wnt2B                         别以0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L 终浓度加入苦参碱，每
              可以通过经典 Wnt 途径调节肿瘤的发生发展，Wnt/                       组设 6 个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对
              β⁃catenin 通路激活后，胞浆中的β⁃catenin 表达上                 照，分别处理24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT溶
              调 ［6］ ，GSK⁃3β作为 β⁃catenin 上游重要的负性调控               液（5 mg/mL），继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入
              因子，其失活与β⁃catenin 的表达呈正相关 。                        150 μL DMSO 溶解 MTT，于 490 nm 处检测光密度
                                                   ［7］
                  苦参碱（matrine）是一个四环的喹嗪啶类生物碱，                    （optical density，OD）值 ，计 算 抑 制 率 ，抑 制 率 =
              广泛存在于豆科植物苦参、山豆根和苦豆子中 。苦                           ［（OD 空白组-OD 实验组 ）/OD 空白组 ］×100%。
                                                      ［8］
              参碱具有广泛的药理作用，如抗炎、抗肝纤维化、镇                           1.2.2 细胞侵袭实验
              痛和抗心律失常等，苦参碱制剂不良反应较少，应                                 将 Transwell 小室放入 24 孔板，4 ℃预冷后，上
              用广泛 。已有研究表明其具有良好的抗肿瘤特                             室加入 1∶4 稀释的 Matrigel，待凝固后，上室加入无
                    ［9］
              性，参与调节肿瘤增殖、凋亡、血管生成、侵袭迁移                           血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20%
              等相关的多条信号通路            ［10-14］ 。且有研究表明，苦参          FBS 的培养基，待细胞沉降后上室分别加入 0.4、0.8
              碱在人白血病细胞、乳腺癌以及人鼻咽癌细胞中，                            g/L 终浓度苦参碱，每组设 6 个平行孔，加入相同体
              均可通过抑制 Wnt/β⁃catenin 信号通路的激活降低                    积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，取出小室，磷
              癌细胞生长活性和诱导其分化               ［15］ 。故本研究将基          酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后-
              于 Wnt/β⁃catenin 信号通路研究苦参碱抑制宫颈癌                    20 ℃预冷甲醇固定 5 min，用棉签轻轻拭去上室未
              细胞系Caski细胞侵袭迁移的分子机制。                              迁移的细胞，结晶紫染色 5 min，PBS 漂洗，拍照，计
                                                                数。
              1  材料和方法
                                                                1.2.3 细胞迁移实验
              1.1  材料                                                将Transwell小室放入24孔板孔，上室加入无血
                  人宫颈癌细胞系 Caski 细胞购于中国科学院典                      清培养基配制的细胞悬液 400 μL，下室加入 20%
              型培养物保藏委员会细胞库。苦参碱（上海源叶公                            FBS的培养基，待细胞沉降后上室分别加入0.4、0.8 g/L
              司）；MTT、二 甲 亚 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、          终浓度苦参碱，每组设6个平行孔，加入相同体积的
              DMEM 高糖培养基（北京索莱宝生物科技有限公                           溶媒作为空白对照，处理 24 h 后，取出小室，PBS 漂
              司）；Transwell 小室（Millipore 公司，美国）；基质胶              洗后-20 ℃预冷甲醇固定5 min，用棉签轻轻拭去上
             （Matrigel，BD 公司，美国）；胎牛血清（fetal calf se⁃            室未迁移的细胞，结晶紫染色5 min，PBS漂洗，于倒
              rum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；MMP⁃9                     置显微镜观察拍照，统计细胞迁移率。
              ELISA 试剂盒、VEGF ELISA 试剂盒（上海酶联生物                   1.2.4 ELISA实验
              科技有限公司）；RIPA 裂解液、SDS⁃PAGE 凝胶试剂                         取对数生长期细胞，加入 0.4、0.8 g/L 终浓度苦
              盒、山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技术有限公                             参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h
              司）；TRIzol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂                      后，收集无血清培养基，参照ELISA试剂盒说明书检
              盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗β⁃catenin 单克                     测培养基中MMP⁃9、VEGF含量。
              隆抗体、兔抗 p⁃β⁃catenin 单克隆抗体（Abcam 公司，                1.2.5 qRT⁃PCR实验

              英国）。引物序列：GSK⁃3β上游 5′⁃CACCTCTGGC⁃                       取对数生长期细胞，加入 0.4、0.8 g/L 终浓度苦
              TACCATCCTTAT⁃3′，下游 5′⁃ATTATTGGTCTGTC⁃             参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h
              CACGGTCT ⁃ 3′ ；Wnt2B 上 游 5′ ⁃ GTGTCCTGGCTG⁃       后，加入 1.5 mL TRIzol 于冰上吹打细胞，室温静置
              GTTCCTTA ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃ AGCTGGTGCAAAGGAA ⁃        5 min，13 000 r/min离心5 min，吸取上清，加入氯仿，
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