Page 43 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期 郑荣芳，刘 伟，张芸中，等. 苦参碱调控Wnt/β⁃catenin途径抑制宫颈癌细胞系Caski细胞侵袭迁移［J］.
2021年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：035-040 · 37 ·

静置离心，吸取上清加入异丙醇，静置离心，弃去上 的延长而逐步增大（图1），显示苦参碱对Caski增殖
清，75%乙醇清洗沉淀，离心弃上清，保留沉淀干燥， 抑制作用具有时间、浓度的依赖性。
用 DEPC 水溶解。然后按照 TaKaRa 反应试剂盒依
0.1 g/L
次经过去除基因组 DNA 反应、反转录反应和 qPCR 100 0.2 g/L
进行扩增，扩增程序为：95 ℃ 10 min 预变性；95 ℃ （ % ） 80 0.4 g/L
0.8 g/L
-ΔΔCt 计算基因
15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s 40个循环。2 60 1.6 g/L
的表达量，其中ΔΔCt=（待测样品目的基因的 Ct 平 增殖抑制率 40
均值-待测样本看家基因的 Ct 平均值）-（对照样品
20
目的基因的 Ct 平均值-对照样本看家基因的 Ct 平
0
均值）。 24 h 48 h 72 h
1.2.6 Western blot实验 图1 苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用（n=6）
Figure 1 Inhibitory effect of matrine on proliferation of
取对数生长期细胞，加入 0.4、0.8 g/L 终浓度苦
Caski cells（n=6）
参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h
后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，4 ℃ 2.2 苦参碱对Caski细胞侵袭的影响
放置 30 min，13 000 r/min 离心 10 min，取一部分上 随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞侵
清，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，另取部分上清加入 袭的数量逐渐减少，且与空白组相比，0.4、0.8 g/L处
4×上样缓冲液，煮沸变性后，加到 4%浓缩胶浓缩， 理组差异均具有统计学意义（P＜0.01，图2）。
10%分离胶分离，再经过转膜、封闭，4 ℃孵育一抗 2.3 苦参碱对Caski细胞迁移的影响
（其中β⁃catenin抗体以1∶2 500稀释，p⁃β⁃catenin抗体 随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞迁移的
以1∶1 000稀释），室温孵育二抗，ECL发光液显色，X 数量逐步减少，且与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组
医用胶片显影、定影等步骤，最后进行拍照分析。 差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图3）。
1.3 统计学方法 2.4 苦参碱对Caski细胞MMP⁃9、VEGF含量的影响
采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，所有数 随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞上清培
据均以均数±标准差（x ± s）表示，多组间比较采用单 养液中MMP⁃9、VEGF含量均逐步降低，与空白组相
因素方差分析，两两比较采用 LSD⁃t 检验，P＜0.05 比，0.4、0.8 g/L 处理组差异均具有统计学意义（P＜
为差异具有统计学意义。 0.05，P＜0.01，表1）。
2.5 苦参碱对 Caski 细胞 GSK⁃3β、Wnt2B mRNA 表
2 结 果
达的影响
2.1 苦参碱对Caski细胞增殖的影响 随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞内
随着苦参碱浓度的不断升高，Caski细胞增殖抑 GSK⁃3β mRNA表达量逐渐增加，Wnt2B mRNA表达
制率呈逐渐增大的趋势。在苦参碱浓度＞0.1 g/L 量逐渐减少，与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组差异
时，相同浓度下，对Caski 细胞的抑制率随作用时间 均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图4）。

苦参碱浓度（g/L）
0 0.4 0.8 *
*
200
180
（ 个 ） 160
侵袭细胞数 140
120
100
80
60
40
20
0
0 0.4 0.8
苦参碱浓度（g/L）
两组相比，P＜0.01，n=6。
*
图2 不同浓度的苦参碱对各组细胞Caski侵袭能力变化的影响（结晶紫染色，×200）
Figure 2 Effects of different concentrations of matrine on Caski invasiveability in each group（crystal violet staining，×200）