Page 48 - 南京医科大学自然科学版第1期
P. 48

第41卷第1期
               · 42  ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年1月


                  阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种             1.2  方法
              神经系统退行性疾病，起病隐匿并呈进行性发展。                            1.2.1 细胞培养
              AD 病变主要发生在大脑皮层及脑区，AD 的病理特                              小鼠海马神经元来源的 HT⁃22 细胞，用含 10%
                                 ［1］
              征包括认知功能障碍 、脑皮质神经元减少退化 、                           胎牛血清的 MEM 高糖培养液（100 U/mL 青霉素和
                                                         ［2］
              神经细胞内神经原纤维缠结、细胞外老年斑及脑实                            100 mg/L 链霉素），在37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度
              质血管淀粉样变性等。Tau蛋白是一种微管相关蛋                           条件下培养，细胞贴壁生长后加入分化液（Neuro⁃
              白，在脑细胞中的功能是与其他微管蛋白结合形成                            basal 培养基和 N2 添加剂）培养 24 h。当细胞呈对
              微管，并保持其稳定性。相关研究证实了 AD 患者                          数生长时，进行分组实验。
              脑中磷酸化 Tau（p⁃Tau）蛋白数量异常增加 ，同时                      1.2.2 实验分组
                                                     ［3］
              动物实验表明，AD 模拟动物的相关脑细胞内 p⁃Tau                            HT⁃22 细胞以不同浓度的 OA（20、40、60、80、
              水平出现同样变化，因此 Tau 蛋白的过磷酸化成为                         100 nmol/L）处理，不加OA的细胞作为对照，分别进
              AD病变评估的关键标志物，对抗Tau蛋白过磷酸化                          行 MTT 实验和 Annexin V⁃FITC/PI 双染色检测细胞
                                            ［4］
              也成为AD治疗的一个重要切入点 。                                 活性及凋亡情况。后续实验以 OA 作用 HT⁃22 细胞
                  姜黄色素（curcuminoids）是我国传统中药姜黄                   的半数抑制浓度（IC50 ）作为实验浓度，分为对照组：
              的主要活性成分，姜黄素（curcumin，Cur）是其中一种                    HT⁃22 细胞未经任何处理因素；Cur 组：姜黄素（20
              单体，通过抑制β淀粉样蛋白（amyloid β⁃protein，Aβ）               μg/mL）作用 HT⁃22 细胞 24 h；OA 组：80 nmol/L OA
                                                    ［5］
              的产生和聚集，对神经系统显示出保护作用 。大脑                           作用HT⁃22细胞24 h；OA+Cur 组：OA（80 nmol/L）加
              中细胞外大量淀粉样蛋白的沉积是AD的主要病理                            入HT⁃22细胞12 h后加姜黄素（20 μg/mL）处理细胞
              变化之一，动物试验表明姜黄素可以使 AD 鼠大脑                          12 h进行后续检测。
              中相关神经细胞外的Aβ淀粉样蛋白减少，并能预防                           1.2.3 MTT检测细胞活力
                             ［6］
              这种蛋白的生成 。但姜黄素对 AD 相关细胞内另                               HT⁃22细胞生长至对数生长期时，0.25%胰酶消
              一主要病理变化，即p⁃Tau的影响有待深入研究。                          化贴壁细胞，完全培养基终止消化，并调整至100 μL
                  AD 的发病机制尚未明确。目前研究表明，神                         5 000个细胞后接种于96孔培养板，每组5个复孔，待
              经元细胞在Tau蛋白磷酸化后可产生多种神经毒性                           细胞贴壁后进行分组实验，设立调零孔，分别培养12、
                                          ［9］
              损害，如缺血缺氧        ［7-8］ 、氧化应激 、炎症    ［10］ 和老化 ［11］  24、48 h后，向各孔内加10 μL MTT溶液，置于培养箱
              等。本研究用冈田酸（okadaic acid，OA）诱导 HT⁃22                继续培养1 h后中反应，在酶标仪上于波长450 nm处
              小鼠海马神经元细胞，并以一定浓度的姜黄素处                             测各孔吸光值。细胞活力（%）=（实验组吸光值-调零
              理，探讨姜黄素对OA诱导的HT⁃22细胞的作用及其                         孔吸光值）/（对照组吸光值-调零孔吸光值）×100%。
              对凋亡及氧化应激的影响，对 AD 的治疗有重要临                          1.2.4 Annexin V⁃FITC/PI 双染色检测细胞凋亡
              床指导意义。                                                 按照 Annexin V⁃FITC/PI 双染色凋亡检测试剂
                                                                盒说明书进行操作。取胰酶处理后的对数生长期细
              1  材料和方法
                                                                胞，调整细胞浓度接种于6孔培养板（2×10 个/孔），待
                                                                                                     5
              1.1  材料                                           细胞贴壁后，进行分组实验，分别培养 24 h，PBS 轻
                  小鼠海马神经元来源的 HT⁃22 细胞系，购自赛                      轻洗涤 2 次，各组依次加入 195 μL Annexin V⁃FITC
              百慷（上海）生物技术股份有限公司，姜黄素、冈田                           结合液、5 μL AnnexinV⁃FITC 混匀，5 μL PI 混匀，暗
              酸（Sigma公司，美国），MEM培养液（Invitrogen公司，                盒中放置10 min后，置于荧光显微镜下观察并拍照记
              美国），胎牛血清、N2培养基添加剂、Neurobasal培养                    录，并以流式细胞仪（绿色荧光FITC和红色荧光PI分
              基（Gibco 公司，美国），活性氧检测试剂盒、MTT 细                     别采用FL1和FL3通道）检测凋亡细胞数。

              胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V⁃FITC/PI                   1.2.5  DCFH⁃DA 荧光探针荧光显微镜测定细胞活
              细胞凋亡检测试剂盒、DCFH⁃DA荧光探针检测试剂                         性氧（reactive oxygen species，ROS）水平

              盒（上海碧云天生物技术有限公司），ChemiDoc                    TM        取胰酶处理后的对数生长期细胞，调整细胞浓
                                                                                        5
              XRS凝胶成像系统（Bio⁃Rad 公司，美国），BD FACS⁃                 度接种于6孔培养板（2×10 个/孔），分组处理后，收集
              Verse 流式细胞仪（BD 公司，美国），Leica DM14000               各组细胞，将DCFH⁃DA稀释为终浓度10 μmol/L。去
              荧光显微镜（莱卡公司，德国）。                                   除细胞培养液，加入1 mL稀释好的DCFH⁃DA。荧光
   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53