Page 37 - 南京医科大学自然科学版第1期

第41卷第1期 崔海鹏，林映雪，王怡宁，等. Urantide对动脉粥样硬化大鼠脂肪肝组织中STAT3磷酸化的影响［J］.
2021年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：029-034 · 31 ·

表1 RT⁃qPCR的引物序列 1.3 统计学处理
Table 1 The sequences of the primers for RT⁃qPCR 实验结果数据采用 SPSS 21.0 统计软件进行分
基因 引物序列（5′→3′） 析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，均符合正
STAT3 上游：AAAGGACATCAGTGGCAAGA
态分布，采用单因素方差分析进行组间比较，以P <
下游：ACATCGGCAGGTCAATGGTA
0.05为差异有统计学意义。
β⁃actin 上游：CAGGCATTGCTGACAGGATG
下游：TGCTGATCCACATCTGCTGG 2 结 果

-ΔC T 大鼠胸主动脉及肝组织病理特征
mRNA CT 值的差值为ΔCT，采用 2 法计算各组 2.1
mRNA的相对表达量。以上操作均按照试剂盒说明 如图 1 所示，正常组胸主动脉血管内皮细胞排
书进行操作。 列整齐，中膜弹力纤维层结构完整清晰，血管平滑
1.2.4 免疫印迹检测 肌细胞整齐排列，内膜、中膜、外膜分界清晰完整；
采用 RIPA 裂解液及匀浆仪提取肝组织的总蛋 AS 组血管内皮细胞显著损伤，出现钙化，中膜弹力
纤维断裂，呈现典型的 AS 病理特征；Urantide 组血
白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。45 μg
蛋白上样于SDS⁃PAGE分离、转膜和5%脱脂奶粉溶 管内皮细胞损伤恢复明显，钙化显著消失，中膜平滑
液室温封闭 1 h，一抗 p⁃STAT3（1∶800）、STAT3（1∶ 肌细胞及弹力纤维恢复尚可。相应地，正常组肝细胞
1 000）、β⁃actin（1∶10 000）于 4 ℃摇床孵育过夜；洗 形态结构正常，肝小叶结构，正常肝索排列均匀规则；
膜后，加入二抗（1∶5 000），室温孵育 1 h，洗膜后用 AS组肝细胞明显肿胀变形，肝索排列紊乱，肝小叶界
超敏 ECL 化学发光试剂盒显影。Image J 软件测定 限不清晰，细胞质中出现大量空泡样脂滴，部分细胞
蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。 核偏向细胞一侧，为典型的肝细胞脂肪变性；Urantide
1.2.5 组织免疫荧光法检测 组肝细胞形态明显恢复正常，肝索排列尚可，肝小叶
取制备好的肝组织石蜡切片样本，经二甲苯脱 结构形态基本趋于正常组。这提示VD3联合特制高
蜡、梯度乙醇水化后，抗原修复，10%山羊血清封闭， 脂饲料可以成功诱导大鼠 AS 和脂肪肝发生，而且
一抗p⁃STAT3（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；洗片后，暗室 Urantide可有效减轻AS病变及肝脂肪变性。
中滴加 FITC 标记二抗（1∶1 000），37 ℃孵育 1 h，弃 2.2 大鼠肝系数和ALT、AST水平
去二抗，加入 DAPI 染液，孵育 45 min，洗片，防荧光 如图 2 所示，与正常组相比，AS 组大鼠肝系数
淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察。每组选3张飞 显著升高（P < 0.05）；Urantide组大鼠肝系数较AS组
片，每张飞片选取 3 个不同视野进行拍照。Image⁃ 显 著 降 低（P < 0.05），较 正 常 组 显 著 升 高（P <
Pro Plus 6.0软件计算免疫荧光阳性细胞的平均光密 0.05）。相应的，与正常组相比，AS 组大鼠血清中
度值，取平均值作统计学分析。 ALT、AST水平显著升高（P < 0.05），Urantide 组血清

正常组 AS组 Urantide组

胸主动脉

肝组织

图1 各组大鼠胸主动脉及肝组织病理变化（HE染色，×400，标尺=20 μm）
Figure 1 Morphological characters of thoracic aorta and liver tissues in rats of each group（HE staining，×400，scale bar=20
μm）