Page 128 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第11期
·1690 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年11月
（1.1），这种 Cas9 变体降低了 Cas9 与非互补链 DNA 开发的 evoAPOBEC1⁃BE4max，可以提高 CBE 在 GC
的亲和力。利用类似的原理，Kleinstiver 等 ［10］ 开发 序列上的编辑效率。当目标位点附近存在多个C时
了高保真突变体 SpCas9⁃HF1。Chen 等 ［11］ 利用 eSp⁃ 会出现旁观者脱靶现象，设计编辑窗口更窄 ［22-23］ 或
Cas9（1.1）和 SpCas9⁃HF1 在与非靶向序列结合时会 序列依赖 ［24］ 的脱氨酶可以有效降低这种旁观者脱
转换成非活跃状态的机制对野生型 Cas9 进行氨基 靶活性。虽然碱基编辑器不会产生 DSB，但碱基切
酸突变，获得了兼具高切割活性和低脱靶活性的 除修复发生时仍会有插入/缺失副产物，BE4融合一
HypaCas9。Casini 等 ［12］ 在酵母上对 Rec3 结构域突 种噬菌体来源的断裂末端保护蛋白Mu Gam可以有
变的 SpCas9 文库进行筛选，鉴定出了四重突变体 效减少 CBE 介导的插入/缺失 ［20］ 。通过优化脱氨酶
evoCas9，尽管这一突变体特异性很高，但也极大地 TadA与nCas9切口酶（D10A）之间的连接序列，可以
降低了编辑活性。Lee 等 ［13］ 利用大肠杆菌筛选出 得到编辑效率更高的ABEmax ［25］ 。Richter等 ［26］ 通过
Sniper⁃Cas9，在降低脱靶活性的同时，也能保持与野 噬菌体辅助进化进一步优化了TadA，得到的ABE8e
生型SpCas9相当的编辑活性。 版本极大地提高了A·T到G·C的编辑效率，但也造
相对于野生型 SpCas9 的编辑活性，绝大部分 成了较为严重的脱靶效应。
Cas9 高保真突变体的基因编辑活性均下降，虽然 由于碱基编辑器使用的脱氨酶会与单链 DNA
Sniper⁃Cas9 保持了和野生型 Cas9 相当的基因编辑 和RNA结合，尤其是CBE，会在单链DNA和RNA上
活性，但是特异性比其他突变体低 ［14］ 。因此，开发 产生高频率的脱靶 ［27-28］ 。为了减少碱基编辑器的脱
高活性和高特异性的突变体Cas9势在必行。 靶，Zhou等 ［29］ 通过破坏脱氨酶与RNA的结合能力开
发了 3 个 CBE 变异体和 1 个 ABE 变异体，极大地提
2 基因编辑技术的安全性
高了碱基编辑器的保真性。
基因编辑技术的深入研究和广泛应用暴露了 2.2 先导编辑器
［3］
其出乎意料的安全性问题，如Cas9介导DNA双链断 Auzalone等 开发的先导编辑器，可以精准实现
裂（double⁃strand breakage，DSB）会导致 DNA 大片 12种点突变和小片段的插入/删除。先导编辑器包
段缺失和染色体易位 ［15］ ，Cas9 的表达会激活 P53 括nCas9切口酶（H840A）和逆转录酶结构域，以及
通路 ［16］ ，Cas9在临床应用中存在潜在的抗原抗体反 3′端携带目标突变的逆转录模板和负责起始转录
应等 ［17］ 。碱基编辑器、先导编辑器、Cas9 活性的精 的引物结合位点（primer binding site，PBS）的 pe⁃
准调控等在一定程度上可以解决安全性问题。 gRNA。在 pegRNA 引导下，nCas9 切割并释放非互
2.1 碱基编辑器 补链，释放的非互补链与 pegRNA 3′端 PBS 序列互
DSB 的产生对细胞来说是非常严重的事件，基 补配对后，逆转录酶以 pegRNA 3′端携带的模板进
于Cas9开发的碱基编辑器既避免了DSB的产生，又 行逆转录，新合成的 DNA 通过 DNA 修复机制实现
实现了高效编辑。目前已开发出两类碱基编辑器： 点突变或小片段的插入/删除。与传统同源重组方
［18］
胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor，CBE） 和 法相比，先导编辑器具有更高的编辑效率和更好的
［19］
腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor，ABE） 。 靶向灵活性。
CBE使用胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶（C）脱氨基产生 2.3 CRISPR/Cas9活性的精确调控
尿嘧啶（U），在DNA修复和复制过程中，U被聚合酶 2.3.1 抗CRISPR蛋白
识别为胸腺嘧啶（T），诱导 C 到 T 的突变；ABE 使用 随着天然拮抗剂 anti⁃CRISPR（Acr）蛋白的发
细菌中人工进化而来的腺苷脱氨酶（TadA）催化腺 现，科学家开始选择这些蛋白用于控制Cas9蛋白的
嘌呤（A）转换成肌苷（I），在复制和修复的过程中 活性 ［30］ 。Acr 蛋白干扰 CRISPR⁃Cas9 系统的方式主
DNA聚合酶将I识别为G，引入A到G的突变。 要是与sgRNA竞争性结合Cas9蛋白，或者直接抑制
最初的 CBE 版本 BE3 具有序列偏好性和较高 Cas9 核酸酶活性。已阐明Ⅱ型 Acr 蛋白与 Cas9 的
的脱靶活性，在目标位点会出现一定比例的错误突 直接相互作用 ［31-32］ ，限制了其与 DNA 结合，或阻止
变（C 突变成 A 或 G）。BE4 在 BE3 基础上将尿嘧啶 了 HNH 核酸酶结构域的激活 ［33］ 。由于 Acr 蛋白具
糖基化酶抑制蛋白（uracil glycosylase inhibitor pro⁃ 有严格的开关控制作用，因此可以实现对 Cas 核酸
tein，UGI）增加到两个，提高了编辑效率，降低了脱 酶的精准调控，例如在 CRISPR 系统发挥作用之后
靶活性 ［20］ 。Thuronyi等 ［21］ 利用噬菌体辅助进化技术 转入AcrⅡA4可有效减少脱靶编辑 。
［34］
