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第41卷第11期 谭 磊，陈明月，沈 彬. 基因编辑研究进展与展望［J］.
2021年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（11）：1689-1694 ·1691 ·
2.3.2 光调控 Cas9的免疫原性也增加了临床使用的风险。另外，
通过光激活的方式也可以对Cas9活性进行精确 体外合成的gRNA也会引发免疫反应 ［44］ ，对gRNA进
调控。光调控是非入侵性的，可以实现对Cas9核酸 行修饰可以增加稳定性，抑制免疫反应 。
［45］
酶活性的可逆控制。Hemphill等 使用光锁定赖氨 虽然在Cas9的安全性方面已经做了诸多改进，
［35］
酸，设计出了一种光控Cas9，通过在细胞中添加进化 但一些未知及潜在的安全性问题仍是 Cas9 编辑技
［36］
产生的吡咯酰tRNA（PylT）/tRNA合成酶（PCKRS） ， 术走向临床应用的障碍，因此开发易调控 Cas9 突
可以使光锁定赖氨酸特异性地掺入 Cas9 中。这种 变体、抑制 TP53 激活的 Cas9 突变体、低免疫原性
光控的 Cas9 核酸酶在 365 nm 光照射 120 s 后，其活 Cas9 突变体等可以为基因治疗提供更安全、更有
性可以恢复到野生型水平。Nihongaki 等 ［37］ 报道了 效的工具。
一种光激活Cas9（paCas9），利用一种光诱导二聚化蛋
3 基因编辑器的在体转导
白 ，将Cas9的两个片段分别连接磁性蛋白的正负
［38］
极，在蓝光照射下，异源二聚体相互配对，重组的pa⁃ 高效的基因编辑取决于将编辑器有效地传递
Cas9与野生型Cas9活性没有显著差异。 到体内细胞和组织中，在体转导对基因编辑来说是一
此外，Zhang 等 ［39］ 报道了一种通过光控 crRNA 个很大的挑战。目前大多数研究使用腺相关病毒
来调控 CRISPR⁃Cas9 活性的方法，这一策略将维生 （Adeno associated virus，AAV）和慢病毒进行在体转
素 E 与 5′ 不 耐 光 连 接 子 偶 联 合 成 了 一 种 新 的 导基因编辑，存在以下问题：①病毒载体的容量有限；
crRNA，维生素 E 修饰会抑制 Cas9⁃crRNA/tracrRNA ②持续性的表达会造成脱靶效应；③递送载体本身会
与DNA的结合，在365 nm紫外光照射下，维生素E和 引发独特的免疫反应；④潜在的致癌性。
不耐光接头被去除，恢复CRISPR⁃Cas9系统的功能。 AAV 载体可以携带约 4.4 kb 的外源 DNA，具有
2.3.3 小分子抑制剂 多种血清型，对不同组织具有不同的亲和性 ［46-47］ 。
Choudhary 实验室开发了一种高通量筛选平 使用分子量更小的 SaCas9 或将 SpCas9/碱基编辑器
台 ［40］ ，鉴定出一种小分子 SpCas9 抑制剂 BRD0539， 分成两部分，再通过内含子蛋白剪接系统重组克服
对这种抑制剂进行优化后可以将 SpCas9 的活性降 了运载能力的限制 ［48-49］ 。当然，从自然界中或者通
低78%。BRD0593调控Cas9的活性是可逆的，并且 过蛋白工程，寻找或者开发更小版本的 Cas 蛋白是
对蛋白酶有抵抗力，可在人血浆中稳定存在，其对 解决 AAV 运载限制更好的选择 ［50］ 。AAV 的另一个
CRISPR⁃Cas9 进行精准地时空调控，具有广阔的应 缺点是对天然血清型存在先天性体液免疫反应，这
用前景。 很大程度上限制了其应用 ［51］ ，通过对AAV的衣壳进
［52］
2.4 P53效应与免疫原性 行改造可以减轻这一影响 。
CRISPR⁃Cas9的细胞毒性在不同细胞系中有所 慢病毒载体可以容纳长达10 kb的外源DNA ，
［53］
不同，这种毒性与细胞中 P53 蛋白介导的细胞凋亡 并将其半随机整合到基因组中。慢病毒可以与不
通路相关。在对人细胞系转染Cas9后，携带野生型 同包膜蛋白进行组装，以靶向不同的细胞类型 ［54］ 。
TP53 基因的细胞系表现出更高的细胞周期停滞水 与AAV不同的是，慢病毒携带的基因会整合到细胞
平 ［41］ 。Enache 等 ［16］ 发现，在人类癌细胞系中引入 基因组中，由此产生的核酸酶长期表达对细胞不
Cas9 会导致 p53 通路的上调，诱导细胞凋亡。Ihry 利。整合酶缺陷慢病毒载体具有瞬时表达和更弱
等 ［42］ 在对人类多能干细胞进行编辑时，Cas9诱导的 的整合能力，可以解决这一问题 ［55］ 。最近，有研究
双链断裂会让大多数细胞死亡，这种细胞毒性主要 开 发 了 一 种 类 病 毒 载 体 ，可 以 直 接 包 装 Cas9
依赖于 TP53 激活，所以大大降低了携带野生型 mRNA，使其不会整合到靶细胞的基因组中，可以在
［56］
TP53细胞的基因编辑效率，也就意味着如果使用经 小鼠组织中转导和瞬时表达核酸酶 。
过筛选的编辑细胞用于细胞治疗，这些细胞TP53突 由于病毒载体存在一些难以避免的缺陷，目前
变或者低表达，可能会导致癌症的发生。因此在利 也开发了一些非病毒传递载体 ［57］ 。基因编辑器的
用基因编辑细胞进行治疗时，监测TP53的状态尤为 非病毒载体传递效率低于病毒载体，但是它提供了
重要。除了引起P53效应，Charlesworth 等 ［43］ 对人类 瞬时核酸酶活性的优势。更重要的是，非病毒载
血清进行免疫印迹检测时发现，34例捐赠者中至少 体，如脂质纳米颗粒、电穿孔技术等可以重复多次
一半人的血清中含有 SaCas9 和 SpCas9 抗体，因此 给药 ，这也为基因疾病治疗提供了更多的可能。
［58］
