Page 54 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第11期
               ·1616 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年11月


              后提取 50 μL 置于滤器中，室温孵育 2 min，完毕后                    1.2.4 实时荧光定量PCR检测
              以 10 000 r/min 离 心 1 min，最 后 提 取 miRNA 并               提取不同组患儿血液中的RNA，合成针对miRNA
              于-80 ℃低温冰箱保存备用。                                   和相应内参的反转录引物，使用实时荧光定量检测
              1.2.3 miRNA标记、芯片杂交及生物信息学分析                        试剂盒（Qiagen 公司，美国）进行逆转录合成 cDNA
                                                     TM    TM
                  将 提 取 好 的 总 RNA 用 miRCURYHy3 /Hy5             从而进行实时定量 PCR 反应实验。其中包括 2 μL
              Power Labeling Kit（Exiqon，Vedbaek 公司，丹麦）进         dNTPs、10 × PCR 缓冲液 2.5 μL、Taq 聚合酶 2 U、
              行miRNA标记。将RNA溶解于事先配制好的杂交液                         Sybergreen Ⅰ终浓度0.25×、10 μmol/L上游引物1 μL、
             （15%甲酰胺2.4 μL，0.2% SDS 3.2 μL，3×SSC 2.4 μL，        10 μmol/L下游引物1 μL、4 μL cDNA模板以低速短
              50×Denhardt 1.6 μL，DEPC 6.4 μL）中，通过升温并            暂离心。相应参数设置：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、
              混匀后放置于-20 ℃环境下 10 min，随后于 95 ℃下                   60 ℃ 60 s，45 个循环；在 60 ℃处进行单点荧光检
              变性 3 min。将 RNA 加至 3.0 版本 microRNA 芯片，             测收集。反应产物相对表达量使用公式2                      − ΔΔCT  法
              漂洗后于室温下离心甩干。                                      进行分析。

                  用 Axon GenePix 4000B microarray scanner（Ax⁃   1.3  统计学方法
              on Instrument 公司，美国）进行扫描，扫描图像导入                        将所有数据输入SPSS 23.0统计软件，计量资料
              GenePix Pro 6.0 software（Axon）对miRNA芯片扫描数         用均数±标准差（x ± s）表示，两样本均数的比较采用

              据进行提取分析。miRNA 数据用 Median normaliza⁃               独立样本 t 检验，计数资料以率（%）表示，组间比较
              tion 进行标化，miRNA 信号值在所有组中≥50 才被                    则用χ 检验。通过绘制受试者工作特征（receiver
                                                                      2
              选择，重复的 miRNA 取平均值。数据分析采用                          operating characteristic，ROC）曲线分析 miR⁃6833⁃3p
              Mann⁃Witney检验，差异表达的miRNA的选择标准：                    在ARDS患儿中的诊断效能，并计算诊断灵敏度、特
              差异倍数 >2 或<0.5，P < 0.01。表达芯片热图用                    异度及准确性，曲线下面积（area under cure，AUC）
              MEV software（v4.6，TIGR）进行制作。实验和后续                 比较采用 Z 检验。相关性分析采用 Pearson 相关分
              的基因芯片数据分析由北京博奥生物有限公司辅                             析。P＜0.05为差异有统计学意义。
              助完成，随机取 10 个样本制作芯片。选取靶基因
                                                                2  结 果
              数据集（TargetScan 与 microrna.org 两个数据库预测
              的靶基因交集）与候选数据集（与目标基因表达                             2.1  两组基本临床资料的比较
              相关的差异基因）进行交集，进行基因功能和信                                  两组性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、剖宫产
              号通路分析（GO 和 Pathway 分析），找出可能的作                     等一般资料的比较，差异均无统计学意义（P 均>
              用靶标。                                              0.05，表1）。

                                                  表1 两组临床基本资料的比较
                                        Table 1 Comparison of basic clinical data of two groups
                  组别       例数     男/女（例）     胎龄（周，x ± s）    出生体重（g，x ± s）     母亲年龄（岁，x ± s）      剖宫产［n（%）］
                对照组         32      18/14     39.41 ± 1.14     3 357 ± 236       29.06 ± 4.56      21（65.6）
                ARDS组       25      15/10     38.52 ± 1.65     3 535 ± 208       28.76 ± 3.94      18（72.0）
                χ /t值               0.38         0.60             0.66              0.26            0.362
                 2
                P值                  0.62         0.50             0.57              0.80            0.531


              2.2  miRNA芯片测试结果                                  ⁃4754、miR⁃6833⁃3p 和 miR⁃192⁃3p，4 个表达下调的
                  两组血清miRNA进行定量分析，共筛选出24个                       基因分别是 miR⁃362⁃3p、miR⁃11a、miR⁃7a⁃2⁃3p 和
              与新生儿 ARDS 相关的高表达（差异倍数为 2 倍以                       miR⁃1382。
              上且组内差异小）的差异基因。在 24 个 miRNA 中                      2.3  筛选基因的实时荧光定量PCR验证
              有14个在ARDS组血清中明显上调，10个miRNA明                            为进一步避免 miRNA 基因之间互相杂交的缺
              显下调。进一步进行差异筛选发现，这24个基因中                           点，使用实时荧光定量PCR对筛选的如上基因进行
              有 4 个表达上调和 4 个表达下调均超过 5 倍且组内                      了验证，结果发现miR⁃6833⁃3p在ARDS组中的表达

              差异微小的基因，4个上调的分别是miR⁃31⁃5p、miR                     为对照组的9.23倍，差异有统计学意义（P<0.01），且
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