Page 33 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第2期 徐万里，周 帅，周静珠，等. 低频耳针电刺激降低内脏敏感性的机制探讨［J］.
2021年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（02）：181-186 ·183 ·

波，持续30 min，每天1次，治疗5次/周，共治疗2周。 表1 qPCR引物序列
1.2.3 腹外斜肌肌电测定 Table 1 Primer sequences of qPCR
实验前 1 周大鼠双侧腹外斜肌处埋植电极，导 引物名称 序列（5′→3′）
线留置于大鼠背部。测试前禁食 24 h，固定大 Nesfatin⁃1⁃F GACTCGGCATGAGGAGTTTAAG
Nesfatin⁃1⁃R GGCTTCTTCCTCTTTCCTCTTC
鼠。电极导线经切口引出连接 BL⁃420 生物机能实
CRF⁃F TCCGCATGGGTGAAGAATAC
验系统。导尿管经液体石蜡润滑后插入大鼠直肠
CRF⁃R AAAGTTAGCCGCAGCCT
约 4 cm。待大鼠安静后开始记录，测试参数：标准
CRF1R⁃F TGACAGCCGCCTACAATTAC
电压 2 mV/cm，时间常数 2 s，高频滤波 30 Hz。向导 CRF1R⁃R GTGGAGTACGTGAGCACAAT
尿管球囊充气，分别予 20、40、60、80 mmHg 压力观 CRF2 R ⁃F GTCACCAACTTCTTCTGGATGT
察 EMG 变化。通过 BL⁃420 配套计算机软件截取 CRF2 R ⁃R GACAATGATAGGGCAGGGTATG
20、40、60、80 mmHg 压力 4 个时段中 1 min 内波形 5⁃HT4R⁃F TCGGCATAGTTGATGTGATAGAG
5⁃HT4R⁃R GAGGAGAAACGGGATGTAGAAG
EMG，配套软件计算该时间段曲线下面积（area un⁃
der curve，AUC，单位：μV·s），并计算与静息状态 GAPDH⁃F GGGAAACCCATCACCATCTT
GAPDH⁃R CCAGTAGACTCCACGACATACT
1 min内AUC的差值。
1.2.4 远端结肠组织HE染色 AUC较空白组明显升高（P均＜0.05，图1），提示IBS
3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（4 mg/100 g）后处 内脏高敏感模型造模成功。
死，迅速开颅、开腹，冰上快速取下丘脑、结肠组织， 空白组与模型组大鼠结肠 HE 染色后镜下观
固定于 4%多聚甲醛 24 h 以上，依次梯度乙醇进行 察，结肠组织结构正常，未见炎细胞浸润，肠黏膜未
脱水。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。修 见增厚，固有层未见分离，肠绒毛形态结构正常，未
块，切片，脱蜡至水、染色、冲洗伊红染色、乙醇脱水 见脱落（图2）。
封片。显微镜镜检，图像采集分析。 2.2 低频耳针电刺激对内脏高敏感的作用
1.2.5 实时荧光定量PCR（Real⁃time PCR） 结直肠球囊压力为20 mmHg时，与模型组AUC
同上操作，快速取下丘脑、结肠组织，置于液氮 比较，耳针 1 组 AUC 显著减少（P＜0.05）；耳针 2 组
和-80 ℃冰箱备用。TRIzol 试剂盒提取下丘脑内总 AUC有下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。
RNA，反转录合成cDNA。引物序列如表1。反应体 在 40 mmHg 及 60 mmHg 压力时，与模型组比
系 ：反 应 液 10 μL，5 × Primescript Buffer 4 μL，5 × 较，耳针 1 组、耳针 2 组 AUC 均明显减少（均 P＜
Primescript RT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 0.05）。在压力为80 mmHg时，耳针1组AUC较模型
4 μL，DEPC 水 1 μL。反应条件：95.0 ℃ 10 min； 组显著下降（P＜0.05），耳针 2 组有下降趋势，但无
95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 1 min，40个周期；95.0 ℃ 15 s 熔解 统计学差异（图 3）。腹外斜肌 EMG 结果提示，耳针
曲线。根据real⁃time PCR原始检测结果，按照2 -△△Ct 1 组与耳针 2 组均有缓解模型大鼠内脏高敏感性的
相对定量计算公式，计算目的基因相对定量结果。 效应，且耳针1组效应更加显著。
1.3 统计学方法
采用 SPSS22.0 软件对数据进行统计分析。数 25
空白组
据均以均数±标准差（x ± s）表示，符合正态分布和 模型组
20 *
方差齐性的两组计量资料比较采用独立样本 t 检
验，多组计量资料比较采用单因素方差分析。组 （ μV·s ） 15
间两两比较采用 LSD 法。P＜0.05 表示有显著统 AUC 10 *
计学差异。 *
5
2 结 果
0
20 mmHg 40 mmHg 60 mmHg 80 mmHg
2.1 内脏高敏感模型大鼠建立
与空白组比，P＜0.05。
*
腹外斜肌 EMG 显示，结直肠内置球囊压力为 图1 不同结直肠压力下腹外斜肌肌电AUC
20 mmHg时，与空白组相比，模型组AUC差异无统计 Figure 1 AUC of external oblique under different colorec⁃
学意义（P＞0.05）；在40、60、80 mmHg压力时，模型组 tal pressure