Page 38 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第2期
               ·188 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年2月


              沉 淀 ⁃ 测 序（chromatin immunoprecipitation high ⁃    设置 3 个复孔，独立重复 3 次。YY1 上游引物：5′⁃
              throughput sequencing，ChIP⁃seq）结果表明YY1可以          CTTTTCACTGGACTTCAATTTGCG⁃3′；下游引物：5′⁃
              直接与长链非编码RNA SOX2OT的启动子区结合 ，                       CACTGGTTGTTTTTGGCCTTAGC⁃3′；SOX2OT 上游
                                                         ［6］
              表明 YY1 可能调控 SOX2OT 的转录，SOX2OT 可能                  引物：5′⁃AGACAGCTCTGTTCAGTATT⁃3′；下游引
              参与胰腺癌的发生和进展。本研究以人胰腺癌细                             物：5′⁃TTACACCAGCCTCCAAGA⁃3′；GAPDH 上游
              胞株 BXPC⁃3 和 PANC⁃1 为研究对象，探讨 YY1/                  引物：5′⁃ACGGGAAGCTTGTCATCAAT⁃3′；下游引
              SOX2OT 轴在胰腺癌细胞迁移和侵袭中的作用，为                         物：5′⁃TGGACTCCACGACGTACTCA⁃3′。
              YY1作为胰腺癌早期诊断、预后及治疗的靶标提供                           1.2.3 Western blot
              理论依据。                                                  使用 RIPA 细胞裂解液抽提细胞总蛋白，并用

                                                                BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。蛋白加 1 ×
              1  材料和方法
                                                                SDS 上样缓冲液后于 100 ℃水浴 5 min，取 20 μg 进
              1.1  材料                                           行 SDS⁃PAGE 电泳，而后把蛋白质转移至 PVDF 膜
                  人胰腺癌细胞株 BXPC⁃3 和 PANC⁃1 购于上海                  上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000 一抗，4 ℃过
              细胞所；YY1过表达及YY1干扰的稳转细胞株由本                          夜，TBST 洗涤 3 次，加二抗（1∶2 000）室温孵育 1 h，
              实验室构建及保存 ；PBS、胰酶、DMEM 高糖培养                        TBST洗3次，然后用ECL化学发光试剂于暗室自显
                               ［4］
              基、胎牛血清（Wisent 公司，加拿大）；双抗（青、链霉                     影。用成像分析系统拍照记录并进行灰度分析。
              素）、RIPA 细胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白浓度测定                     1.2.4 细胞划痕实验
              试剂盒、GAPDH 抗体、二抗（上海碧云天）；TRIzol、                         先用记号笔在 6 孔板背面划横线，每隔 0.5~
              Lipofectamine 3000 转 染 试 剂（Invitrogen 公 司 ，美      1.0 cm一道，横穿过孔；每孔至少穿过5条线。在孔
              国）；反转录试剂盒、SYBR green master mix、蛋白                中加入 5×10 个细胞。第 2 天用枪头垂至于背后的
                                                                            5
              Marker（Bio⁃Rad公司，美国）；PVDF膜、ECL试剂盒、                横线划痕。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入
              Transwell 小室（Millipore 公司，美国）；Matrigel 基质         无血清培养基，放入 37 ℃、5%CO2培养箱培养。按
              胶（BD公司，美国）；细胞培养耗材（Corning公司，美                     0 h、24 h时间点取样，拍照。
              国）；YY1抗体（Abcam公司，美国）；其他常用试剂均                      1.2.5 Transwell细胞侵袭实验
              为国产分析纯；引物由上海吉玛设计合成；siRNA片                              将Matrigel 1∶8稀释，包被Transwell小室底部膜
              段由广州锐博设计合成；定量 PCR 仪为美国 ABI                        的上室面，置 37 ℃ 30 min，使 Matrigel 聚合成凝胶。
              Stepone plus 型号；倒置荧光显微镜为美国 Nikon                  使用前进行基底膜水化。细胞撤血清饥饿12 h后，
                                                                                              5
              Ti⁃E 型；成像分析系统为美国 Protein simple Fluo⁃             消化细胞，调整细胞密度至 5×10 个/mL，取细胞悬
              rchem 型。                                          液 100 μL 加入 Transwell 小室。24 孔板下室加入
              1.2  方法                                           600 μL含20%胎牛血清的培养基，放入37 ℃ 5%CO2
              1.2.1 细胞培养                                        培养箱培养 24 h。随后取出 Transwell 小室，弃去孔
                  BXPC⁃3 和 PANC⁃1 细胞使用含 10%胎牛血清、                中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定30 min，将小室适当
              50 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素的DMEM高糖培                    风干。0.1%结晶紫染色 20 min，用棉签轻轻擦掉上
              养基，在37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养，待细胞融合                      层未侵入细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随机
              率为 70%左右时，以 0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺                    5个视野观察细胞，记数。
              四乙酸消化、传代。                                         1.2.6 SOX2OT过表达慢病毒及稳转细胞株构建

              1.2.2 定量RT⁃PCR                                         SOX2OT过表达慢病毒及其对照病毒由上海和
                  使用TRIzol试剂抽提细胞总RNA。分光光度法                      元公司构建。将全长人 SOX2OT 亚克隆入 pLenti⁃

              测定浓度后，根据说明，使用 1 μg 总 RNA 和 iscript                CMV⁃MCS⁃3FLAG H155载体，测序验证。YY1过表
              cDNA 合成试剂盒在 20 μL 的最终体积中进行逆转                      达BXPC⁃3细胞（BXPC⁃3⁃YY1）感染SOX2OT过表达

              录（RT）。采用 SYBR green master mix 在定量 PCR            慢病毒或对照慢病毒。6~8 h 后换液并在荧光显微
              仪 中 进 行 定 量 PCR。 采 用 2       - ΔCt  法 ，即 用 YY1/   镜下观察荧光，批量扩增培养后用嘌呤霉素进行细
              SOX2OT（靶基因）的 Ct 值减去 GAPDH（内参基因）                   胞筛选，加药浓度由低到高，直至细胞正常培养状
              的Ct值，计算相对基因表达量。每一个定量PCR均                          态，筛选出稳转细胞株（BXPC⁃3⁃YY1⁃SOX2OT 和
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