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第41卷第2期 王 娟，吴 涛，何 斌，等. circ_0001246调节miRNA30a对骨肉瘤化疗敏感性影响的机制研究［J］.
2021年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（02）：198-202 ·199 ·

骨肉瘤是原发性骨肿瘤中发病率最高的恶性 Glo 荧光素酶检测试剂盒（Promega 公司，美国）；脂
肿瘤，其恶性程度甚高，预后极差，具有易侵袭转 质体 3000 和 TRIzol（Invitrogen 公司，美国）；MTT 试
移、易耐药等生物学特性，即使采用手术联合化疗 剂盒（Sigma 公司，美国）；Annexin V⁃FITC/7AAD 凋
的治疗方案，患者 5 年生存率也仅为 50%~60％，随 亡双染色试剂盒（南京 KeyGEN 公司）。依托泊苷
着基因治疗等生物治疗技术的发展，骨肉瘤综合治 （etoposide⁃VP16）由南京医科大学第二附属医院药
疗有了新进展。而进一步提高骨肉瘤化疗的敏感性、 剂科提供。
探究骨肉瘤的分子调控机制并制定新的靶向治疗策 1.2 方法
略是骨肉瘤诊治的关键 ［1-2］ 。环状RNA（circRNA）最 1.2.1 转染
早在RNA病毒中被发现，已经证实在哺乳动物的细 细胞转染使用脂质体3000，按照试剂盒说明将
胞质中大量存在，具有特异性强、结构稳定、表达丰 MG63 和 U2OS 细胞随机分为 3 组，分别置于 6 孔板
度高等特点，可以参与转录和转录后基因的表达调 中，包括未转染组（空白组）、siRNA阴性对照转染组
控，在多种疾病和病理生理过程中具有重要的调控 （NC组）和siRNA转染组（circ_0001246 siRNA）。转
作用 ［3-4］ 。目前研究表明，circRNA 可作为竞争性内 染后通过FAM荧光标记水平评价转染效率。

源RNA（ceRNA）发挥基因表达调控作用，即circRNA 1.2.2 转 染 后 检 测 各 组 细 胞 circ_0001246、miR⁃
拥 有 miRNA 应 答 元 件（miRNA response element， NA30a的表达
MRE），可结合miRNA 阻断后者对靶RNA 的抑制作 转染后 48 h 采用实时荧光定量 qRT⁃PCR 检测
用，从而调控 miRNA 靶基因的表达水平，在胞浆内 3 组细胞 circ_0001246、miRNA30a 的表达。按 Taq⁃
发挥了miRNA“海绵”功能，与很多种肿瘤的发生发 Man miRNA分离试剂盒说明书提取细胞总RNA，用
展以及治疗有着密切关系 ［5-6］ 。本团队一直致力于 分光光度计定量检测。RNA 样品用逆转录反应合
研究circRNA对于骨肉瘤的影响，发现circ_0001246 成 cDNA 后 ，用 TaqMan miRNA 分 析 试 剂 盒 检 测
在骨肉瘤的发生发展中发挥了重要作用，已通过实 RNA 含量。特异性引物序列：circ_0001246 正向引
验证实circ_0001246 在骨肉瘤组织和细胞中的表达 物 5′⁃TCTCATCTCATTCGTCTGATTGGA⁃3′，反向引
上调，起到癌基因的作用 ［7-8］ ，然而其对骨肉瘤化疗 物 5′ ⁃ ATCTTCATTCCGTGAGGCAATGTT ⁃ 3′ ；miR⁃
的影响及具体机制还未有相关文献报道。本研究 NA30a 正向引物 5′⁃TACAGTACTGTGATAACTGAA⁃
通过体外实验探讨了circ_0001246调节miRNA30a、 3′，反向引物5′⁃GTGCAGGGTCCGAGGT⁃3′；内参U6
影响骨肉瘤化疗敏感性的相关分子机制。 正向引物 5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′，反向引物
5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCGT⁃3′。 反应条件为
1 材料和方法
95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，70 ℃ 1 s，
1.1 材料 40个循环。反应结束后得到各个标本和内参U6的基
人骨肉瘤细胞株 MG63 和 U2OS 由华中科技大 本循环数（CT值），根据公式计算目的基因相对含量。
学同济医院骨科实验室提供。正常成骨细胞株OB3 1.2.3 转染后检测各组细胞对依托泊苷的敏感性
购于武汉细胞模式培养中心。MG63 和 U2OS 细胞 转染后将骨肉瘤细胞 MG63 加到 24 孔板上，分
系在 RPMI 1640 培养基中培养（南京 KeyGEN 公 为 3 组，加入 100 μmol/L 的依托泊苷，用流式细胞
司），并加入 10%胎牛血清（Gibco 公司，美国）。在 AnnexinV/7AAD 双染法检测不同时间（6、12、24 h）
37 ℃、5%CO2条件下培养。 肿瘤细胞凋亡情况。
TaqMan miRNA 分离试剂盒、TaqMan miRNA 逆 1.2.4 荧光素酶报告基因实验验证circ_0001246的

转录试剂盒、TaqMan miRNA 分析试剂盒和 TaqMan 作用
通 用 PCR master mix（Applied Biosystems 公 司 ，美 构建荧光素酶报告基因，将 circ_0001246 的线
国）；miRNA30a模拟物、阴性对照（NC）和FAM标记 性序列携带 1 个预测 miRNA30a 结合位点导入 psi⁃

的NC（上海Gima公司）；circ_0001246 siRNA、siRNA CHECK 质 粒。合 成 目 的 序 列 为 5′ ⁃ TCTTCAAT⁃
阴性对照（NC）和 FAM 标记的 siRNA NC（南京 Key⁃ GATTTTGTTTACA⁃3′，用引物进行 PCR 扩增，经 Spe
GEN 公司）；荧光原位杂交试剂盒（广州 RiboBio 公 Ⅰ和HindⅢ酶切后连接到psiCHECK质粒。利用两
司）；pMIR⁃Report载体（Ambion公司，美国）；限制性 步PCR法将突变的片段导入预测的miRNA30a结合
内切酶 SpeⅠ和 HindⅢ（大连 TaKaRa 公司）。Dual⁃ 位点，通过测序确定克隆产物的 DNA 序列。MG63