Page 44 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第2期
               ·194 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年2月


                  肺癌是世界范围内发病率和病死率最高的恶                           1.2  方法
              性肿瘤之一 。据中国癌症统计报告，中国2015 年                         1.2.1 DNA提取
                        ［1］
              有 429 万例肺癌新发病例，281 万例肺癌死亡病                             采用 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 试剂盒（批
              例 ［2-3］ 。肺癌患者中约 80%为非小细胞肺癌（non⁃                   号157050679，凯杰公司，德国），按照试剂盒说明书
                                                                                           ®
              small⁃cell lung cancer，NSCLC），60%~70%的 NSCLC      操作，提取 DNA。采用 Qubit 2.0 fluorometer dsD⁃
              患者首诊时已处于中晚期 ，失去了手术治疗机                             NA HS assay Kit 试剂盒（批号 1871944，赛默飞世尔
                                       ［4］
              会。近年来以表皮生长因子受体（epidermal growth                   公司，美国）检测提取 DNA 的浓度和纯度。琼脂糖
              factor receptor，EGFR）⁃ 酪 氨 酸 激 酶 抑 制 剂（tyro⁃      凝胶电泳检测DNA的片段化程度。
              sine kinase inhibitor，TKI）为代表的靶向治疗取得              1.2.2  高通量测序技术检测 EGFR、KRAS、BRAF、
              飞速发展。研究表明，EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、                    NRAS、Her⁃2和PIK3CA基因突变

                                                                                       ®
                                                                                               TM
              PIK3CA 和 Her⁃2 等 基 因 的 突 变 状 态 与 NSCLC                 DNA 采用 Agencourt AMPure XP beads（贝克
              患 者 TKI 靶向治疗的疗效、肿瘤转移以及预后相                         曼库尔特公司，美国）进行纯化。采用肺癌文库制
              关 ［5-7］ 。因此，全面准确地检测相关基因显得尤为                       备试剂盒（赛默飞世尔公司，美国），按照说明书操
              重要。                                               作，进行扩增、片段化，连接接头和条码，从而获得
                  目前常用的基因检测方法主要有 Sanger 测序                      DNA 文库。采用 Ion PGM Template OT2 Reagents
              法、高通量测序技术、实时荧光定量PCR法、微滴式                          200 试剂盒（批号4481107，赛默飞世尔公司，美国），
              数 字 PCR 技 术（droplet digital PCR，ddPCR）等 。         按照说明书操作，利用 Ion OneTouch 仪器进行油包
              Sanger 测序法被认为是基因检测的“金标准”，但其                       水 PCR 反应，Ion OneTouch ES 仪器进行模板富集。
              操作步骤繁琐、耗时长、检测灵敏度不高。高通量                            采用 Ion PGM   TM  Sequencing Supplies 200 v2 测序试
              测序技术具有海量检测分析能力，能够一次检测多                            剂盒（批号 4482007，赛默飞世尔公司，美国），上机
              个基因的多个突变位点序列，节省肿瘤样本 DNA。                          测序，要求测序平均深度＞1 000 倍，测序区域均一
              ddPCR 技术是一种新发展起来的检测方法，其具有                         度＞95%。采用 Iontorrent variant caller plugin v4.0
              更高的精度和灵敏度，且可绝对定量。                                 软件分析结果。
                  本研究应用个体化基因组测序（personal genome                 1.2.3 Sanger测序法检测EGFR基因突变
              machine，PGM）平台，对 150 例 NSCLC 患者 EGFR、                  运用PCR仪扩增EGFR 基因18~21外显子目的
              KRAS、BRAF、NRAS、Her⁃2 和 PIK3CA 基因突变状               片段，引物参考文献［8］。采用 Cycle⁃Pure Kit 纯化
              态进行检测并分析，同时采用 Sanger 测序及 ddPCR                    试剂盒（批号 D6492⁃02，Omega Biotek 公司，美国），
              技术对150例NSCLC患者EGFR基因突变状态进行                        按照说明书操作纯化 PCR 产物。采用 Big Dye Ter⁃
              检测并加以对比分析。                                        minator v3.1 kit（批号 1705129，赛默飞世尔公司，美
                                                                国）进行测序反应，纯化，运用ABI 3500Dx 基因测序
              1  材料和方法
                                                                仪进行测序。
              1.1  标本                                           1.2.4 ddPCR法检测EGFR基因突变
                  病例纳入标准：①病理证实为NSCLC；②年龄大                            采用美国 Bio⁃Rad 公司 QX200 Droplet Digital
              于18岁；③有可测量病灶（CT测得长径≥10 mm）；④                      PCR 系统，按照商用试剂盒 Prime PCR             TM  ddPCR TM
              心电图、血常规、肝肾功能、骨髓功能基本正常；⑤                           Mutation Detection Assay Kit（批号1863107、1863103、
              患者及家属知情并同意。病例排除标准：①造血                             1863104、1863105、1863106，美国 Bio⁃Rad 公司）说
              功能严重障碍者，肝肾功能严重损害者；②精神                             明书操作，检测EGFR基因18外显子p.G719S，19外
              病患者；③怀孕或哺乳期妇女。按照病例纳入及                             显子 p.E746_A750del，20 外显子 p.T790M，21 外显
              排除标准收集江苏大学附属宜兴医院和南通大                              子 p.L858R 和 p.L861Q 位点突变状态。阳性判定：
              学附属医院 2016 年 5 月— 2018 年 6 月就诊患者                 “ch1+ch2⁃”区的点≥3个。
              160 例作为研究对象。肿瘤组织标本来源于研究                           1.3  统计学方法
              病例穿刺或术后福尔马林固定石蜡包埋样本。                                   采用 SPSS 19.0 统计学软件进行分析，定性资
              本研究所有患者均知情同意，并经医院医学伦理                             料组间比较采用卡方检验，P < 0.05 为差异有统计
              委员会批准。                                            学意义。
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